| Popis: |
Precise regulation of the cell cycle events is essential for correct DNA replication and successful cell reproduction. Progression through the cell cycle is tightly controlled over a multisite phosphorylation network. Phosphorylation of specific amino acids (phosphory-lation sites, or phosphosites) might either activate a protein or send it for degradation if phosphorylation occurs inside the destruction box called degrons. In this work, C-terminal degron from Saccharomyces cerevisiae Cln2 cyclin was used to generate a set of multisite phosphorylation protein tags. The protein tags were tested for their ability to regulate protein expression by their fusion with GFP and monitoring its fluorescence. GFP fusion with a longer degron containing 5 phosphosites resulted in the stronger drop in the fluorescence, in comparison to a four phosphosites degron. When the distance between two phosphosites in the Cln2 degron was shortened from 21 to 12-18 amino acids, GFP fluorescence significantly dropped. Generated degron can be potentially used for the regulation of target protein levels. In addition, the contribution of the Cln2 promoter on Cln2 oscillation waves during the cell cycle was analyzed. Analysis of the expression patterns of Cln2 and GFP with a short half-life under the control of Cln2 promoter showed that Cln2 fall in the early S phase is likely due to phosphorylation of protein degron, while promoter role is to provide a sufficient num-ber of transcripts to ensure adequate levels of Cln2 in G1 phase. In estonian: Rakutsükli sündmuste täpne regulatsioon on vajalik täpseks DNA replikatsiooniks ja rakkude jagunemiseks. Rakutsükkel on reguleeritud valkude multifosforüleerimise kaudu. Kindlate positsioonide – fosforüleerimissaitide – fosforüleerimine võib valke aktiveerida või ka suunata lagundamisele, kui fosforüleerimine toimub degradatsioonimotiivides. Käesolevas töös kasutati Saccharomyces cerevisiae tsükliini Cln2 C-terminaalset degradatsioonimotiivi selleks, et luua multifosforüleeritavaid valgumärgiseid. Vastavad märgised liideti GFP valguga ning mõõtes fluorestsentsi analüüsiti nende mõju liitvalgu ekspressioonile. Viie fosforüleerimissaidiga märgise lisamine GFP valgule alandas flu-orestsentssignaali tugevamalt kui nelja saidiga märgise lisamine. Lisaks, fosforüleerimissaitide vahelise distantsi vähendamisel 21 aminohappejäägi pealt 15-18 jä-ägini langes oluliselt ka GFP liitvalgu fluorestsents. Seega, loodud degradatsioonimotiive saab kasutada valkude tasemete langetamiseks. Järgnevalt analüüsiti ka Cln2 promootori mõju Cln2 ekspressiooniprofiilile rakutsüklis. Cln2 promootorilt ekspresseeritud tsükliini Cln2 ja ebastabiilse GFP ekspressiooniprofiilide analüüsil selgus, et Cln2 taseme langus va-rajases S faasis toimub ilmselt degradatsioonimotiivi fosforüleerimise tõttu, samas kui pro-mootori roll on kindlustada piisav CLN2 transkriptide arv saavutamaks vajalikku valgu taset G1 faasis. |
