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Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eine Erkrankung, deren Inzidenz in den letzten Jahrzehnten vor allem in den westlichen Industrieländern stark zugenommen hat. Die Entstehungsmechanismen sind insbesondere auf molekularer Ebene komplex und Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den von Maspin regulierten Genen DUSP4 (MKP-2) und IQGAP2 im kolorektalen Karzinom. Das Ziel der Arbeit war basierend auf Vorarbeiten mittels molekularbiologischer Methoden Expression und Funktion der Gene beziehungsweise der Proteine näher zu charakterisieren. Dabei sollten Schlussfolgerungen gezogen werden in welcher Form DUSP4 und IQGAP2 die Tumorentwicklung beeinflussen und welche weiteren tumorrelevanten Marker möglicherweise mit DUSP4 und IQGAP2 assoziiert sind. Die Expression von DUSP4 wurde abhängig vom Probenmaterial anhand von RT-qPCR, Western Blot, Immunhistochemie und Immunzytochemie an CRC-Zelllinien und Patientenmaterial unter Berücksichtigung der Patientendaten untersucht. Die Expressionslevels wurden mit tumorrelevanten Markern korreliert und die Promotormethylierung analysiert. Für funktionelle Studien in vitro wurde DUSP4 in CRC-Zelllinien überexprimiert und der Einfluss auf potentielle Downstream-Targets sowie die Proliferation von Zellen beobachtet. Die Expression von IQGAP2 wurde ebenfalls an CRC-Zelllinien und Patientenmaterial mit Hilfe von RT-qPCR und Western Blot untersucht. Außerdem wurden die Promotormethylierung und die subzelluläre Lokalisation von IQGAP2 in CRC-Zelllinien analysiert. Für funktionelle Studien wurde ein IQGAP2-Expressionsvektor erstellt und IQGAP2 in vitro in CRC-Zelllinien überexprimiert beziehungsweise mittels siRNA Technik supprimiert. Dabei wurde der Einfluss auf potentielle Downstream-Targets sowie Migration und Apoptose von Zellen untersucht. Schließlich wurden auch Maspin-überexprimierende und supprimierende CRC-Zelllinien analysiert, um den regulatorischen Zusammenhang zu IQGAP2 weiter einzugrenzen und den Einfluss von Maspin auf weitere tumorrelevante Gene zu untersuchen. Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass DUSP4 im CRC und CRC-Zelllinien überexprimiert ist. Dabei ist die Expression von DUSP4 in Mikrosatelliten-instabilen kolorektalen Karzinomen signifikant höher als in Mikrosatelliten-stabilen Karzinomen. Zudem korrelierte die DUSP4-Expression mit KRAS- und BRAF-Mutationen. Promotormethylierung konnte als Einfluss auf die DUSP4-Expression im CRC ausgeschlossen werden. Die Überexpression von DUSP4 führte in vitro zur Herunterregulierung von Mismatch Repair Genen (MLH1 und MSH2) in einer MSS-Zelllinie und zur erhöhten Expression von Genen, die in der Kontrolle des Zellzyklus involviert sind (CDC25A, CCND1, EGR1, FOS, MYC und CDKN1A), in einer MSI-Zelllinie. Zudem konnte die Überexpression von DUSP4 in vitro die Proliferation von CRC-Zellen steigern. Die Phosphorylierung von ERK konnte durch die Überexpression von DUSP4 nicht verringert werden. Eine Erklärung für diesen Widerspruch wäre, dass die hohe DUSP4-Expression im CRC eine vergebliche Reaktion der Zellen auf einen aktivierten MAP-Kinase Weg ist. Damit kann die Hypothese aufgestellt werden, dass DUSP4 als wichtiger Wachstumsregulator von CRC-Zellen innerhalb eines MAP-Kinase Feedback Mechanismus agiert. Die Wirkung von DUSP4 lässt sich dabei gut mit der erhöhten Proliferationsrate von MSI-CRCs im Vergleich zu MSS-CRCs vereinen. Ob DUSP4 in diagnostischen oder prädiktiven Zusammenhängen als potenzieller Biomarker eingesetzt werden könnte, bedarf weiterer Studien. IQGAP2 war im Großteil der untersuchten CRCs und CRC-Zelllinien im Vergleich zu Normalgewebe herunterreguliert. Da eine Hypermethylierung des IQGAP2 Promotors ausgeschlossen werden konnte, liegen der Herunterregulierung von IQGAP2 wahrscheinlich andere molekulare Mechanismen zu Grunde. Subzellulär war IQGAP2 auf Plasmamembranen und verstärkt Zell-Zell Kontakte konzentriert, sowie teilweise mit F-Actin kolokalisiert. Bei der Überexpression beziehungsweise Suppression von IQGAP2 konnte kein Einfluss auf die Transkription von IQGAP1 festgestellt werden. Eine Suppression von IQGAP2 zeigte keine Expressionsänderungen in Genen, die in der Kontrolle des Zellzyklus involviert sind (CDC25A, CCND1, FOS, MYC und CDKN1A). Auch die Apoptose von CRC-Zelllinien konnte durch IQGAP2 Suppression nicht beeinflusst werden. Es konnte jedoch in vitro gezeigt werden, dass IQGAP2 einen negativen Einfluss auf die Migration von Zellen nimmt und damit einen wichtigen Marker für die Tumorentwicklung im CRC darstellen könnte. Bei der Untersuchung von Maspin-überexprimierenden Klonen konnte mittels Immunfluoreszenz weiter erhärtet werden, dass IQGAP2 von Maspin negativ reguliert wird. IQGAP2 konnte jedoch nicht durch Maspin Suppression induziert werden. Zudem wurde beobachtet, dass die Phosphorylierung von ERK durch Maspin-Überexpression stark erhöht wurde, die Phosphorylierung von AKT durch eine Maspin Überexpression jedoch nicht beeinflusst wird. Dabei konnte ein Einfluss von IQGAP2 auf die Phosphorylierung von ERK und AKT ausgeschlossen werden. Da ERK auch in nicht-transfizierten Zellen deutlich phosphoryliert war, muss noch abschließend geklärt werden, ob Maspin-Überexpression eindeutig die Phosphorylierung von ERK erhöht. Die subzelluläre Lokalisation von β-Catenin war in SW480 Zellen auf den Zellkern konzentriert, wohingegen in Maspin-überexprimierenden Zellen eine gleichmäßige Verteilung von β-Catenin in Zytoplasma und Zellkern beobachtet wurde. Dabei war die Expression von β-Catenin in SW480 und Maspin-überexprimierenden Zellen gleich hoch. Maspin könnte in CRC-Zellen also den Transport von β-Catenin vom Zellkern ins Zytoplasma beeinflussen. Der EMT-Marker E-Cadherin konnte weder in Maspin-überexprimierenden SW480 und Kontrollen noch in Maspin-supprimierten SW48 und deren Kontrollen nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Vimentin-Expression durch Maspin-Überexpression stark reduziert werden. Eine Maspin-Suppression konnte die Vimentin-Expression jedoch nicht induzieren. Zusammenfassend kann angenommen werden, dass DUSP4 im kolorektalen Karzinom mit Mikrosatelliteninstabilität assoziiert ist, die Proliferation von CRC-Zellen in vitro anregt und als wichtiger Regulator des MAP-Kinase Signalwegs agiert. IQGAP2 entfaltet im kolorektalen Karzinom Tumor-hemmende Wirkungen. Es reguliert die Migration von CRC-Zellen in vitro negativ und wird selbst negativ von Maspin reguliert. Maspin steigert die möglicherweise die Phosphorylierung von ERK, beeinflusst die subzelluläre Lokalisation von β-Catenin und supprimiert die Expression von Vimentin. Die Untersuchungen dieser Arbeit deuten also darauf hin, dass DUSP4, IQGAP2 und Maspin wichtige molekulare Funktionen in der Entwicklung des kolorektalen Karzinoms übernehmen. |
