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Die Cytochrom c Nitritreduktasen (ccNir) aus Wolinella succinogenes Wildtyp, K134H-, Q276E-, Y218F- und StopI-Variante wurden sowohl aus der löslichen als auch aus der Membranfraktion zur Homogenität gereinigt. Aus der Membranfraktion wurden sie als Monomer (NrfA) und als Komplex NrfHA mit einem Tetrahäm c-Typ Cytochrom (NrfH) isoliert.Für die Aktivitäten ergaben sich im Vergleich zum Wildtyp für K134H ein Wert von 35 %, für Q276E 60 % und für Y218F 3 %. Die StopI-Variante war inaktiv. Mittels ICP-MS wurde der Gehalt an Eisen, Calcium und Molybdän bestimmt. Die Q276E-Variante zeigte vergleichbare Werte wie der Wildtyp, die StopI-Variante ergab vier Eisen pro Monomer NrfA, was den Verlust des aktiven Zentrums (Häm 1) bestätigt. Der Molybdängehalt von 2-4 % pro Monomer NrfA lässt auf Verunreinigungen mit Nitratreduktase schließen.Die spektroskopische Untersuchung der Reaktion von ccNir mit Hydroxylamin,N- bzw. O-substituierten Derivaten und Hydrazin zeigte, dass ausgehend vom oxidierten Enzym maximal 16 % der ccNir reduziert wurde. Das photochemisch reduzierte Enzym ergab eine spontane Reoxidation mit einer Ausbeute von ca. 90 %. Demzufolge bindet das Hydroxylamin und die N- bzw. O-substituierten Derivate an das Eisenatom von Häm 1 in oxidierter ccNir und reduziert es nicht. Hydrazin bildet eine Ausnahme und reduziert ccNir vollständig.Die X-Band EPR Spektren von ccNir Wildtyp und der untersuchten Varianten zeigen Resonanzen bei g = 2,98 bis g = 1,46, was auf zwei separate Fe(III) low-spin Häme mit nahezu parallelen Imidazolflächen hinweist. Die Signale bei g = 2,5; 2,15; 1,8 und 1,48 in den Spektren der Q276E- und Y218F-Variante sind mikrowellenfrequenzabhängig, was auf ein spingekoppeltes Paar von zwei S = 1/2 Zuständen hindeutet. Die Resonanzen zwischen g = 3,5 bis g = 3,16 werden Fe(III) low-spin Hämen mit nahezu senkrechten Imidazolflächen zugeordnet. Diese Signale fehlen nur in der StopI-Mutante. Resonanzen bei g = 6, welche auf ein Fe(III) high-spin Häm hinweisen, wurden lediglich in den Spektren vom Wildtyp und der K134H-Variante beobachtet. Weiterhin wurden die Signale bei g = 9,8 und g = 3,8, welche auf ein S = 5/2 1/2 gekoppeltes Paar hinweisen, nur in den Spektren des Wildtyps und der K134H-Variante beobachtet. Jedoch wurde bei der K134H-Variante trotz der Gegenwart des high-spin Signals bei g = 6 und den Signalen bei g = 9,8 und g = 3,8 im Perpendicular Mode , die einer S = 5/2 1/2 Kopplung zugeordnet werden können, kein Signal bei g = 9,8 im Parallel Mode gefunden. Magnetische Suszeptibilitätsmessungen mittels SQUID-Magnetometer von ccNir Wildtyp unterstützen die Annahme einer antiferromagnetischen Kopplung der einzelnen Häm-Zentren.Die Kristallisation und die räumlichen Strukturen der ccNir K134H-, Q276E- und Y218F-Variante wurden zusammen mit Prof. A. Messerschmidt durchgeführt. Die Gesamtstruktur von NrfA mit Dimerenbildung und a-Helices als überwiegendes Strukturmotiv sowie die Anordnung der fünf Häme wurde durch die Punktmutationen nicht verändert. In der K134H-Variante wurde das für ccNir hoch konservierte Lysin als proximaler Ligand durch Histidin als proximaler Ligand ausgetauscht. Bedingt durch die relative Starrheit der Aminosäureseitenkette und das Aufliegen des aktiven Zentrums (Häm 1) auf Häm 3 ergibt sich ein ungewöhnlich langer Fe-N Bindungsabstand von 2,43 Å zum His 134. Außerdem wird das distale Wasser durch Acetat ausgetauscht, das auch einen verlängerten Bindungsabstand zwischen dem Carboxylsauerstoff und dem Eisen von 2,37 Å hat. In der Q276E-Variante wurde das Glutamin der Calciumbindestelle durch Glutamat ausgetauscht, dessen zwei Sauerstoffatome zweizähnig koordinieren. In dieser Struktur wird ein achtfach koordiniertes Y(III) Ion anstelle des siebenfach koordinierten Ca(II) Ions gefunden. Weiterhin ändert sich das Oberflächenpotential des aktiven Zentrums. In der Y218F-Variante wurde das Tyrosin nahe dem Eisen des aktiven Zentrums durch ein Phenylalanin ausgetauscht. Durch das Fehlen der Hydroxylgruppe kann keine Wasserstoffbrückenbindung zum distalen Liganden aufgebaut werden. Außerdem ist eine Protonenübertragung auf das Substrat nicht mehr möglich, weshalb die Aktivität signifikant sinkt.In der Struktur des N-Methylhydroxylaminkomplexes der Y218F-Variante ergab sich eine Sauerstoffbindung zum Eisen des aktiven Zentrums (Häm 1) im Vergleich zur Stickstoffbindung beim Hydroxylaminkomplex. Dies steht im Einklang mit DFT-Rechnungen, die von PD Dr. F. Neese durchgeführt wurden. Bei Hydroxylamin wird eine Stickstoffbindung und bei N-Methylhydroxylamin eine Sauerstoffbindung vorhergesagt.Erste Kristalle des Membran-assoziierten Nitritreduktasekomplexes (NrfHA) aus der Q276E-Variante wurden erhalten. Die Strukturanalyse ist noch in Arbeit. |
