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Die Konjugation mit Ubiquitin ist eine wichtige posttranslationale Modifikation in fast allen zellulären Signalwegen. Neben den gut untersuchten K48-Ubiquitinketten, die das Substratprotein zum proteasomalen Abbau markieren, bilden anders verknüpfte Ubiquitinketten Signale, welche das Zielprotein für unterschiedlichste Schicksale bestimmt. In dieser Arbeit wurde eine Methode etabliert, homogene Ubiquitinketten chemisch sowie enzymatisch herzustellen. Zusätzlich wurde mithilfe dieser Ubiquitinketten eine Reihe von Pulldown-Experimenten durchgeführt, um neue kettenspezifische Interaktionspartner zu isolieren. Die Funktionalität dieser Methode wurde durch die Isolation von bereits bekannten Ubiquitinrezeptoren bestätigt; neue Interaktionspartner konnten dagegen nicht gefunden werden.Weiterhin wurde die ektopische Überexpression von Ubiquitin im Zellkultursystem näher untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich diese negativ auf die Proteolyse einiger untersuchter Proteine auswirkte (p53, UbiquitinG76VGFP). Dieser unerwartete Effekt wurde genauer charakterisiert, wobei es starke Hinweise auf die Inhibition eines Ubiquitinrezeptors im Abbauweg dieser Proteine gibt.Desweiteren wurde die Rolle des Ubiquitinrezeptors Rad23 im Zusammenspiel mit dem deubiquitinierenden Enzyms UBP1 in der Entstehung spezifischer Ubiquitinketten untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass Rad23, welches selektiv K48-Ubiquitinketten bindet, diese vor der Deassemblierung durch das DUB UBP1 schützen kann. Die Ergebnisse wurden unter Einsatz von Ubiquitinmutanten erhalten und konnten bisher nicht in einem experimentellen Aufbau mit Wildtyp-Ubiquitin bestätigt werden.Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die allosterische Aktivierung des E2s UbcH5b durch die RING-Domäne von Mdm2 untersucht. Im Zuge dessen wurden Mutanten der RING-Domäne von MdmX (CV und NoLS) in ihrer erworbenen E3 Ligase Aktivität untersucht. Aus den in diesem Teil gewonnen Daten können Schlüsse gezogen werden, dass sie eher in ihrer Multimerisierung als in ihrer E2-Bindung verändert sind. Außerdem wurde gezeigt, dass die Aminosäurereste der NoLS einen Beitrag zur E3 Ligase Aktivität von Mdm2 leisten. |
