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Zweitveröffentlichung. Die Lokalisation von spezifischen mRNAs ist ein hochkonservierter Mechanismus, um die Expression bestimmter Gene posttranskriptional zu kontrollieren. Dadurch wird die räumlich und zeitlich regulierte Translation von Proteinen in subzellulären Kompartimenten ermöglicht. Die lokale Proteinsynthese ist essentiell für viele Vorgänge in der Entwicklung, spielt aber auch in reifen polarisierenden Zellen, einschließlich Neuronen und Gliazellen eine wichtige Rolle. Man nimmt an, dass die Lokalisierung bestimmter mRNAs in die Dendriten reifer Neurone und die anschließende lokale Proteinsynthese zu Veränderungen bei der synaptischen Plastizität führen und infolgedessen an Lern- und Gedächtnisvorgängen im Gehirn beteiligt sind. Für den Transport werden die lokalisierten mRNAs zunächst im Zellkern in Ribonukleoproteinpartikeln (RNPs) verpackt, exportiert und aktiv entlang des Zytoskeletts an den Ort ihrer Bestimmung befördert. Obwohl schon einige Komponenten der Transportmaschinerie identifiziert wurden, ist der zugrundeliegende molekulare Mechanismus der mRNA Lokalisation noch weitgehend unverstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden anhand von drei etablierten Markerproteinen der mRNA Lokalisierung, Barentsz (Btz), Staufen 1 (Stau1) und Staufen 2 (Stau2), Transport-RNPs aus löslichem Rattenhirnextrakt isoliert und deren Zusammensetzung analysiert. Dabei wurde zunächst eine Methode etabliert, die es erlaubt, intakte, neuronale RNPs anzureichern und anschließend mit selbsthergestellten mono-spezifischen Antikörpern zu isolieren. Die Proteine der entsprechenden Transport-RNPs wurden über Massenspektrometrie identifiziert und bestimmte Kandidaten in einer umfangreichen Western Blot-Analyse validiert. Neben einer Vielzahl von RNA-Bindeproteinen, die in verschiedene Gruppen eingeteilt wurden, konnte dabei ein vollständiger Motorproteinkomplex (Kinesin-2) identifiziert werden. Außerdem wurde eine mögliche Protein-Protein Wechselwirkung zwischen Btz und der Casein Kinase II sowie eine RNA-abhängige Interaktion zwischen Stau2 und dem zipcode-Bindeprotein 1 charakterisiert. Zudem gelang der Nachweis von vier dendritisch lokalisierten mRNAs in den endogenen Btz- bzw. Stau2-RNPs mittels RT-PCR. Darüberhinaus ergaben erste Isolierungen von nukleären RNPs deutliche Unterschiede im Vergleich zu den zytoplasmatischen Komplexen. Durch die in dieser Arbeit etablierte Methode gelang der spezifische Nachweis von sowohl Proteinen, als auch von RNAs der RNPs. Somit ist ein erster wichtiger Schritt in Richtung der Entschlüsselung der Transportmaschinerie erfolgt. Diese Daten bilden die Grundlage für zahlreiche zukünftige Studien, die zu einem besseren Verständnis des Mechanismus der mRNA Lokalisation beitragen werden. mRNA localisation is a highly conserved mechanism to regulate the expression of specific genes at a posttranscriptional level. It serves to control both spatial and temporal protein expression at various subcellular sites. The resulting local protein synthesis is known to be required for various processes during development, but is also important in mature polarised cells, including neurons and glia. In neurons it is believed to contribute to the activity-induced plasticity of individual synapses and thus to learning and memory. Localised mRNAs are recognised by RNA binding proteins in the nucleus and cytoplasm and are packaged into ribonucleoproteinparticles (RNPs). After nuclear export RNPs are actively transported along the cytoskeleton to their final destination within the cell. Previous studies have revealed some components of the transport machinery but the underlying mechanism of mRNA localisation is still poorly understood. To elucidate the composition of RNA particles, three protein components of the transport machinery, Barentsz (Btz), Staufen 1 (Stau1) and Staufen 2 (Stau2), were used as molecular handles to isolate RNA transport granules from rat neuronal extracts. A two step isolation procedure was established. First, endogenous neuronal RNPs were biochemically enriched via gradient fractionation. Second, the respective endogenous RNPs were immunoprecipitated using high affinity mono-specific antibodies. Protein components were analysed via mass spectrometry followed by a comprehensive Western blot analyses. In addition to a number of RNA-binding proteins, a complete motor protein complex (Kinesin-2) was identified. Furthermore a putative new protein-protein interaction between Btz and the casein kinase II, as well as a novel RNA-mediated interaction between Stau2 and the zipcode binding protein 1 were characterized. Moreover four localised mRNAs were specifically isolated from endogenous Btz- and Stau2-RNPs. Additionally, preliminary experiments have revealed clear differences between nuclear and cytoplasmic neuronal Btz-, Stau1- and Stau2-RNPs, respectively. Using this biochemical purification method both proteins and RNAs were specifically isolated and identified from endogenous neuronal RNPs. This is a first and important step to elucidate the composition of the mRNA-transport machinery. Based on this data future functional studies will reveal further insight into the mechanism of mRNA localisation. |
