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In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass miniaturisierte direktgekoppelte Systeme gut für die Analytik von biomedizinisch aktiven Substanzklassen eingesetzt werden können. Die Detektion, Quantifizierung, Identifikation und Strukturaufklärung dieser Verbindungen aus limitierten biologischen Probenmatrizes stellt hohe Anforderungen an alle Teilschritte eines solchen Analysengangs, die Optimierung eines jeden Parameters ist daher unumgänglich. Die oftmals bemängelte Robustheit solcher Systeme ist also nur bedingt richtig, im Umgang mit miniaturisierten Analysesystemen ist jedoch, bedingt durch die limitierte Probenmenge, besondere Sorgfalt nötig. Ausgangspunkt der Arbeit war die Herstellung von hocheffizienten Kapillartrennsäulen (250 µm I.D.), welche mit auf die für die jeweilig zu analysierenden Substanzen angepassten stationären Phasen gepackt wurden. Hiefür wurde ein universell anwendbarer Slurry-Packprozeß entwickelt, neben dieser Packsystematik aber auch stabile und reproduzierbare Endfittings zur dauerhaften Fixierung der stationären Phase in der Kapillartrennsäule entwickelt. Diese Kapillarsäulen zeigten im Vergleich zu klassischen HPLC-Säulen mit 4,6 mm I.D. überlegene oder zumindest vergleichbare Trenneigenschaften. Die Kapillartrennsäulen wurden in on-line direktgekoppelten Systemen zum Nachweis von bioaktiven Substanzklassen (Tocopherole, Flavonoide, Phenolsäuren sowie Peptide) eingesetzt. Neben der Detektion mit auf die minimierten Elutionsvolumina angepassten spektrometrischen (ESI/MS) und spektroskopischen Detektoren (UV, Mikroprobenkopf-NMR) wurde auch die MikroSPE als Extraktions- und Anreicherungsschritt on-line gekoppelt. Neben der SPE für flüssige Proben garantiert die MSPD eine schonende und schnelle Extraktion und hohe Anreicherung bei der Analyse von Substanzen aus festen oder hochviskosen Probenmatrizes. Für die Detektion der kleinen Analytmengen wiederum ist die Sensitivität des Detektors mitentscheident. Die Empfindlichkeit hängt neben der Messmethode von geräte-technischen und methodischen Faktoren ab, sollte daher für jeden Detektor einzeln optimiert werden. Für die Massenspektrometrie als sehr sensitive und auch selektive Detektionsart waren neben der Verwendung einer miniatursierten Spray-Nadel vor allem methodische Entwicklungen betreffend einer optimierten Ionisation und Detektion nötig. Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag aber in der Kopplung der Kapillar-HPLC zur NMR-Detektion. Die als relativ unsensitiv geltende NMR hat in den letzten Jahren unter anderem durch die Entwicklung neuartiger Durchfluss-Mikroprobenköpfe weitreichende Verbesserung in den erzielbaren Detektionslimits erreicht, dies gilt besonders für soleniode Mikroprobenköpfe mit einer horizontalen Anordnung der Mikrospule zum B0-Feld. So können nun im stopped-flow Modus Sustanzen bis in den niedrigen Nanogram-Bereich vermessen werden. Dies konnte im Rahmen dieser Dissertation anhand zahlreicher Versuche mittels artifizeller Standards wie auch Realproben nachgewiesen werden. Somit ist die bereits etablierte HPLC-NMR Kopplung nun auch in einer miniaturisierten Variante für robuste Routinemessungen anwendbar. In this thesis, miniaturized hyphenated systems have been successfully applied for analyzing bio-active substances from biological samples. The detection, quantification, identification, and structure elucidation of these compounds from mass-limited samples is demanding, an optimization of each parameter is urgently necessary. After careful optimization, miniaturized hyphenated systems are as robust as, but definitively more sensitive as classical systems. Starting point of the scientific work was the preparation of highly efficient capillary columns (250 µm I.D.) with tailored stationary phases depending on the separation problem. A all-purpose slurry-packing process combined with stable and reproducible frit technology could be introduced guaranteeing superior separation efficiency compared to classical 4.6 mm I.D. HPLC columns. These lab-made capillary columns have been utilized in direct on-line coupled systems to identify bio-active compounds (tocopherols, flavonoids, phenolic acids, and peptides). These hyphenated systems coupled spectrometric (ESI-MS) and spectroscopic (NMR; UV) detectors as well as sample pretreatment units (µSPE) on-line to the capillary separation. For solid or highly viscous samples, matrix solid phase dispersion (MSPD) has been used to extract and enrich the compounds of interest. For the detection of the limited sample amounts, the sensitivity of each detector had to be improved. This could be achieved either by optimized detectors (e.g. NMR microprobes) or methodological improved separations. Major focus of the work was the capillary HPLC-NMR coupling. NMR is regarded as an insensitive detection technique, however, with the newly developed solenoidal microprobes detection limits in the low nanogram range can be achieved in the stopped-flow NMR mode. This major sensitivity improvement of the NMR detection makes the miniaturized hyphenated system ideal for analysing mass-limited samples from biological origin. Different applications presented in the thesis show the robust applicability for real-life analytical tasks. Capillary HPLC-NMR coupling can be regarded as an routine analytical tool. |
