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Resumen La nicotinamida/nicotinato mononucleótido adenililtransferasa (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) desempeña una función central en la síntesis del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NAD) debido a que en esta enzima confluyen las rutas de síntesis de novo y de reciclaje. El NAD es una molécula trascendental en el metabolismo de todos los seres vivos, principalmente en el metabolismo redox. En este estudio se presenta una nueva estrategia metodológica para la evaluación de posibles inhibidores de la NMNAT de Leishmania braziliensis (LbNMNAT). El método suprime la actividad inhibitoria cruzada con la enzima acoplada al ensayo de detección, la alcohol dehidrogenasa (ADH, EC 1.1.1.1). Experimentalmente se introdujo un paso intermedio de extracción en fase sólida de los inhibidores antes de la ejecución del sistema enzimático de detección. La implementación del paso de extracción posibilitó la evaluación específica de la enzima de interés, la LbNMNAT, sin afectar la enzima acoplada ADH. El nuevo método permitió estudiar el efecto inhibitorio de la galotanina, producto natural de especies del género Rhus (Rhus chinensis), en la actividad de la LbNMNAT. Abstract The enzyme nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT, EC 2.7.7.1/18) plays a central role in the nicotinamide and adenine dinucleotide (NAD) synthesis as its de novo and salvage pathways converge in it. NAD is a crucial molecule in the metabolism of all living beings, mainly in redox metabolism. Here we describe a new methodological strategy for the evaluation of possible inhibitors of Leishmania braziliensis NMNAT (LbNMNAT). Our method suppresses the cross inhibitory activity of the enzyme alcohol dehydrogenase (ADH, EC 1.1.1.1) coupled to the detection assay. We improved the specificity of the coupled enzymatic system, by introducing an additional solid-phase extraction step of the inhibitors prior to the execution of the coupled detection system. This step enabled the differentiated evaluation of the LbNMNAT activity without interfering in the coupled ADH enzyme, as well as the assessment of the inhibitory activity of gallotannin, an inhibitor found in Rhus chinensis, on LbNMNAT. |
