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A técnica PCR-RAPD tem sido amplamente empregada em estudos genéticos de populações de vários organismos. Entretanto, devido às interações entre os componentes da reação de PCR é improvável que uma única condição de amplificação possa ser adequada para todas as situações. Com o objetivo de determinar as condições ótimas para a utilização da técnica PCR-RAPD em análises taxonômicas do gênero Atta, foram analisados os fatores: concentrações de MgCl2, DNA, BSA, programas de temperaturas e métodos de extração de DNA, utilizando-se os delineamentos Fatorial Fracionado e o Central Composto. Dentre os fatores avaliados, o método de extração de DNA teve pouca influência na reação, enquanto que o programa de temperatura apresentou o maior efeito. Embora a concentração de MgCl2 seja importante para obtenção de um padrão exato de bandas, seu efeito foi menor do que a quantidade de DNA. Com o aumento da concentração de MgCl2 para 3,0 mM e com a diminuição da concentração de BSA de 0,1% para 0,05% e da quantidade de DNA de 2 para 1 ng/mil ocorreu um aumento significativo no número de fragmentos amplificados, sendo esse efeito observado com maior evidência no programa P2. As condições ótimas estabelecidas para as reações PCR-RAPD foram: 25 mil de solução contendo 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 100 miM de cada dNTP, 0,2 miM de primer, 1,0 U de Taq polimerase, 25 ng DNA (extraído pelo método Cheung) e BSA 0,05%, utilizando-se o programa de amplificação: 3 min. a 94ºC, 3 min. a 35ºC, seguidos de 40 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 36ºC e 2 min. a 72ºC, com extensão final de 5 min. a 72ºC. PCR-RAPD has been widely used for genetic analysis in several organisms. However, due to complex interactions among the components of the PCR reaction it is unlikely that a single amplification condition can be suitable for all situations. In order to determine the optimum conditions for using PCR-RAPD in taxonomical analyses of the genus Atta, the following factors were tested: concentrations of MgCl2, DNA, BSA, cycling programs and methods of DNA extraction, using Fractional Factorial Design and Central Composite Design. DNA extraction methods had little influence on PCR-RAPD reactions, while the cycling programs showed the largest effect. The MgCl2 concentration was less important than the amount of DNA used in the reaction. Using cycling program P2, a significant improvement in the number of DNA fragments was achieved when MgCl2 concentration was increased to 3.0 mM and the BSA and DNA concentrations were reduced from 0.1% to 0.05% and from 2 to 1 ng/mul, respectively. The optimum conditions for PCR-RAPD with Atta specimens obtained in this study were: 25 mul reaction with 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 3.0 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 muM of each dNTP, 0.2 muM of primer, 1.0 U of Taq polymerase, 25 ng template DNA (extracted by Cheung's method) and BSA 0.05%, using the amplification program which consisted of 3 min at 94ºC, 3 min at 35ºC, followed by 40 cycles of 1 min at 94ºC, 1 min at 36ºC and 2 min at 72ºC, and a 5 m final extension at 72ºC. |
