| Popis: |
In dieser Arbeit wurde YM155 anhand eines Neuroblastom-Zellmodells bezüglich seiner antitumoralen Wirkung, sowie möglicher Resistenzmechanismen untersucht. Mit Hilfe eines Viabilitäts-‚Screenings‘ wurde eine Auswahl von 113 chemosensitiven und chemoresistenten Neuroblastomzellen auf mögliche Kreuzresistenzen gegen YM155 untersucht. Hinsichtlich der IC50 Werte gegen YM155, lagen insgesamt 74 % der untersuchten Zelllinien im therapeutisch erreichbaren Bereich von unter 50 nM. Zusätzlich wurden Neuroblastom-, Mammakarzinom- und Prostatakarzinomzellen an eine klinisch relevante YM155 Konzentration adaptiert. Diese zeigten wiederum, dass durch die Adaptierung hervorgerufene Expressionsänderung des ABC-Transporters ABCB1 und des ‚solute carrier‘ Protein SLC35F2 eine bedeutsame Rolle hinsichtlich des Resistenzmechanismus gegen YM155 spielen. Durch den Einsatz von spezifischen ABCB1-Inhibitoren, als auch durch siRNA-vermittelte Reduzierung von ABCB1 konnte eine Abhängigkeit für die Wirksamkeit YM155 von ABCB1 in Neuroblastomzellen bestätigt werden. Des Weiteren wurde in den untersuchten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der Wirkung von YM155 und der Expression des ‚solute carrier‘ Proteins SLC35F2 hergestellt. Dazu wurden Zellen mit verminderter SLC35F2 Expression verwendet, welche durch Transduktion mit einem für eine SLC35F2 spezifische shRNA kodierenden Vektor etabliert wurden. Dabei führte eine verminderte SLC35F2 Expression zu einer starken Minderung der Sensitivität gegen YM155. Das Zusammenspiel dieser beiden Transporter und der damit verbundene Resistenzmechanismus gegen YM155, konnte in fast allen etablierten YM155-resistenten Zelllinien (UKF-NB-3rYM15520, 22RV1rYM155300, PC-3rYM15520, HCC-1806rYM15520 und MDA-MB-231rYM15520) gezeigt werden. Wobei diese Zellen unabhängig von der Tumorentität als Resistenzmechanismus gegen YM155 entweder eine signifikant induzierte ABCB1 Expression (verstärkter YM155 Efflux) und/oder eine verminderte SLC35F2 Expression (verringerter YM155 Influx) entwickelten. Außerdem konnte mit Hilfe der p53-depletierten Zelllinie UKF-NB-3pc-p53 eine Abhängigkeit der YM155 Wirkung vom Tumorsuppressor p53 nachgewiesen werden, wobei es durch die Depletierung von p53 zu einer verminderten Sensitivität der Zellen gegen YM155 kam. Zudem kam es durch die Nutlin-3 hervorgerufene p53 Aktivierung und Akkumulierung zu einer Verstärkung der YM155 Wirkung in den untersuchten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der p53 Status von Zellen einen Einfluss auf deren YM155 Resistenz haben kann. Da in der Behandlung von Neuroblastomen neben der Chemotherapie auch Bestrahlung eingesetzt wird, wurde zusätzlich untersucht ob eine Adaptierung von Neuroblastomzellen an YM155 zu einer verminderten Sensitivität gegen Bestrahlung führen kann. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten UKF-NB-3 Zelllinien (UKF-NB-3 und UKF-NB-3rYM15520) eine ähnliche Sensitivität gegenüber der Bestrahlung aufwiesen, konnte kein Zusammenhang zwischen einer Adaptierung an YM155 und der Ausbildung einer Bestrahlungsresistenz gezeigt werden. Ein weiterer wichtiger Teil dieser Arbeit war es, den primären Wirkmechanismus von YM155 in Neuroblastomzellen zu untersuchen. In vorangegangenen Studien wurde die vom Hersteller beschriebene Wirkung von YM155 als Survivin-Inhibitor in Frage gestellt. Stattdessen soll der primäre Apoptose-induzierende Effekt in erster Linie durch DNA-Schäden hervorgerufen werden, während die Survivin Inhibierung lediglich darauf folgen soll. In einer zeitlichen und konzentrationsabhängigen Kinetik der YM155 Behandlung konnte in UKF-NB-3 Zellen der genaue Zeitpunkt der Survivin-Inhibierung und der Induktion der DNA-Schadensantwort ermittelt werden. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass in Neuroblastomzellen als Antwort auf die YM155 Behandlung zuerst eine Survivin-Inhibierung erfolgt, und die DNA-Schadensantwort als Folge dieser induziert wird. Darüber hinaus belegte die siRNA-vermittelte Survivin-Inhibierung in UKF-NB-3 und UKF-NB-6, dass eine fehlende Survivin Expression die DNA-Schadensantwort induziert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit erstmals in YM155 adaptierten Neuroblastomzellen der Resistenzmechanismus gegen YM155 näher untersucht werden und darüber hinaus wurde demonstriert, dass die Wirkung von YM155 in Neuroblastomzellen nicht auf die Induktion der DNA-Schadensantwort beruht, sondern primär auf die Survivin-Inhibierung zurückzuführen ist. |
