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Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen. The principal subject of this PhD-Thesis was the phosphoinositide-dependent regulation of the P2X2 receptor (P2X2R). P2X receptors are ATP-gated cation channels that are ubiquitous among vertebrates and are expressed especially in central and peripheral nervous system. To date, seven homologous subunits have been cloned which lead to functionally different phenotypes after homotrimeric or heterotrimeric assembly. P2X receptors are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. Due to their involvement in cellular signalling events the term “purinergic signalling” had been established. PI4,5P2, a cellular phospholipid, is anchored at the inner leaflet of the plasma membrane and responsible for many important and essential functions. Beside its well-known functions in physiological processes, it was long time neglected that it also plays a pivotal role in cellular signalling, until this fact was proven in 1980. Furthermore, since several years it is generally accepted that it is also involved in the regulation of membrane transport systems. The first channels for which a strong modulation by this phosphoinositide (PI) isoform was demonstrated were Kir-channels (inward rectifying K+-channels). First, but very preliminary evidence for a PI-based regulation of P2X receptors has been published in 2006. Based on these preliminary results the P2X2R was tested for a potential functional modulation by PIPns with electrophysiological and molecular approaches. For manipulating intracellular PI-levels, heterologous coexpression of the voltage-dependent PI-phosphatase, Ci-VSP, was used. Ci-VSP, which has been cloned from the sea squirt (Ciona intestinalis) in 2005, is an intracellular localized phosphoinositide-phosphatase. Its structure shows high similarity to PTEN, a tumour suppressor PI-phosphatase, and it is able to influence PI4,5P2-sensitive membrane channels, like K+-channels, in a voltage-dependent manner by modulating the PI4,5P2-concentration of the cell membrane. Here it could be shown that coexpression of P2X2R and Ci-VSP in X. laevis oocytes and voltage-dependent activation of the enzymatic activity of Ci-VSP by depolarization influenced the desensitization properties of the P2X2R in two-electrode voltage-clamp measurements. The depolarization induced Ci-VSP activation resulted in an accelerated and intensified receptor current desensitization upon prolonged agonist application. The effect could only be observed in presence of ATP, i.e. when the receptors were active, and the increase in desensitization was more pronounced at more depolarizing potentials. The potential range for the P2X2R effect strongly correlated with that for the Ci-VSP activity as derived from Ci-VSP gating-currents, suggesting that activation of Ci-VSP changed the intracellular PI-metabolism by turnover of the membrane-bound PIPns, resulting in an increased P2X2R desensitization. When oocytes were pre-treated with wortmannin, a PI4-kinase-inhibitor, a similar modulation of receptor current could be observed, suggesting that Ci-VSP-activity and wortmannin interact with the same regulatory pathway. Investigating macroscopic currents in outside out patches of P2X2 receptor expressing oocyte membranes in presence of PIPns and PI-related enzymes it could be demonstrated that only PI4,5P2 had an stimulating effect on receptor function. All other substances tested (including PI3-kinase and PTEN) showed no effect. Comparable results could be reproduced by single channel analysis of P2X2 receptor currents. Due to the fact that the PI4-kinase plays an essential role in the observed effects, the P2X2R sequence was scanned for potential PI4-kinase interaction motifs. These so called SH3-epitopes had been found in many proteins and mediate protein-protein interactions, i.e. interaction between PI4-kinase and membrane proteins. After sequence analysis of the P2X2R a SH3-binding-motif was found in the distal region of the C-terminus which is well-known to play a crucial role in receptor desensitization. This motif was then rendered non-functional by site directed mutagenesis (P2X2-P451A/P454A). The mutant receptor showed an intrinsic increased desensitization virtually identical to the wildtype receptor after wortmannintreatment. Wortmannin-treatment of the mutant receptors did not result in further increase of receptor current desensitization, indicating that the PI4-kinase and consequently PI4,5P2 play an essential role in P2X2R desensitization. Based on these findings, a kinetic model for the P2X2 receptor was developed. Although this model is partially in line with data from other groups it is not fully compatible with results and their interpretation published by FUJIWARA & KUBO [2006]. In addition, the reversible inhibition of P2X2 receptor currents by various aminoglycosidantibiotics was analyzed in detail. After determination of IC50-values, voltage-dependence and ATP-concentration-dependence of receptor current inhibition it could be concluded that aminoglycosides cause a non-competitive open pore block at P2X2 receptors. Using a nondesensitizing P2X2/1 receptor chimera, it could be shown that these antibiotics significantly decelerated the ligand-dissociation from the receptor. This result was interpreted in terms of an increased affinity of the open conformation for ATP when compared to the closed state. Besides the aminoglycoside antibiotics no other substance class is known to inhibit P2X2 receptors with a comparable mechanism. |
