Biodiversität von anti-listeriellen, mikrobiellen Käse-Reifungskonsortien und Detektion eines rekombinanten Yersinia enterocolitica Reporterstammes in Weichkäse

Autor: Maoz, Ariel
Přispěvatelé: Scherer, S. (Univ.-Prof. Dr.), Scherer, Siegfried (Prof. Dr.), Kulozik, U. (Univ-Prof. Dr.)
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2005
Předmět:
Popis: First, the temporal stability and diversity of the bacterial species composition as well as the anti-listerial potential of two different, complex and undefined microbial consortia from red-smear soft cheeses were investigated. Samples from two food producers (R and K) were collected two times each at six months intervals and a total of 400 bacterial isolates were identified by Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy and 16S rDNA sequence analysis. Coryneform bacteria represented the majority of the isolates, with certain species being predominant. In addition, Marinolactobacillus psychrotolerans, Halomonas venusta, Halomonas variabilis, Halomonas sp. (between 106 and 107 cfu per gram smear) and unknown Gram positive bacteria (between 107 and 108 cfu per gram smear) are described for the first time in this environment. The species composition of consortium R was quite stable over a period of six months, but consortium K revealed less diversity of coryneform species as well as less stability. While consortium R had a stable, extraordinary high anti listerial potential in situ, the anti-listerial activity of consortium K was lower and decreased with time. The cause for the anti-listerial activity of the two consortia remained unknown, but is not due to the secretion of soluble, inhibitory substances by the individual components of the consortium. Furthermore, the effect of the ripening temperature on the biodiversity and the anti-listerial activity in situ of undefined red smear cheese ripening consortia was analyzed. Undefined microbial surface ripening consortia of mature retail red smear cheeses produced in dairies R and K were derived twice (I and II). Each of the four consortia (R I, R II, K I, K II) was used for inoculation of soft cheeses, which were ripened at two temperature regimes (13°C and 16/12°C). The bacterial composition of the consortia was analyzed in the smear waters and the corresponding surface floras derived from mature cheeses at the expiry date. A total of 1200 isolates, was identified by FT- IR spectroscopy, partial 16S rDNA sequence analysis of some isolates and physiological methods. Coryneform bacteria represented 78% of the isolates. As far as we are aware, this is the first report on the presence of Vagococcus carniphilus, Psychrobacter spp. and Marinobacter sp. in smear cheese surface floras. Furthermore, the two coryneform bacteria Brachybacterium tyrofermentans and Leucobacter komagatae are described for the first time on German red smear cheeses. The bacterial composition of consortia R I and R II differed significantly. At a ripening temperature of 13°C, in both consortia, the proportions of coryneforms increased from about 82% in the smear water to 96% and even 100% of the isolates in the corresponding surface floras derived at the expiry date. At 16/12°C, their proportions remained about the same level. With respect to the species level, significant flora successions occurred with both temperature regimes. In case of consortia K I and K II the coryneform content decreased with both temperature regimes compared to the initial content in smear water. In K II at 16/12°C, the coryneforms decreased and, instead, Marinolactobacilli dominated, which had not been detected in the smear water of K II. Despite the structural differences of K I and K II in the smear water the trend of reduction of A. nicotianane alongside with an increase of B. linens was similar in both consortia at the 16/12°C regime. While in the case of R I and R II the anti-listerial activity was not affected by the different ripening temperatures, with consortia K I and K II this feature appeared to be dependent on the ripening temperature regime. As a step towards real time and in situ monitoring of pathogens in cold stored soft cheeses with a real product status, bioluminescent mutants of Yersinia enterocolitica were generated by transposon mutagenesis using a promotorless, complete lux operon (luxCDABE) derived from Photorhabdus luminescens. Their production of light in the cheese environment was monitored. Mutant B94, which had the lux cassette inserted into an open reading frame of unknown function was used for direct monitoring of Y. enterocolitica cells on cheeses stored at 10°C by quantifying bioluminescence using a photon counting intensified charge-coupled device (ICCD) camera. The detection limit on cheese was 200 cfu/cm2. Bioluminescence of the reporter mutant was significantly regulated by its environment (NaCl, temperature, cheese), as well as by growth phase, via the promoter the lux operon had acquired upon transposition. At low temperatures, mutant B94 did not exhibit the often-reported decrease of photon emission in older cells. It was not necessary to include either antibiotics or aldehyde into the food matrix in order to gain quantitative, reproducible bioluminescence data. Die zeitliche Stabilität und Vielfalt der Zusammensetzung der bakteriellen Spezies und ebenso das antilisterielle Potential von komplexen und undefinierten mikrobiellen Konsortien von Rotschmiere Weichkäsen wurde untersucht. Proben von zwei Lebensmittelherstellern (R und K) wurden zweimal innerhalb von sechs Monaten gesammelt. Insgesamt wurden 400 Bakterienisolate durch Fourier Transform Infrarot (FT-IR) Spectoskopie und 16S rDNA Sequenz Analyse identifiziert. Coryneforme Bakterien stellten den Hauptteil der Isolate, wobei einige Spezies dominierten. Darüber hinaus wurde Marinolactobacillus psychrotolerans, Halomonas venusta, Halomonas variabilis, Halomonas sp. (106 bis 107 cfu pro gr Schmiere) und unbekannte grampositive Bakterien (107 bis 108 cfu pro gr Schmiere) zum ersten Mal für dieses Biotop beschrieben. Die Florazusammensetzung des Konsortiums R war sehr stabil über eine Zeit von sechs Monaten, während das Konsortuim K eine geringere Vielfalt an coryneformen Bakterien und eine geringere Stabilität zeigte. Während Konsortium R ein stabiles und besonders hohes antilisterielles Potential in situ aufwies, war die anitlisterielle Aktivität von Konsortium geringer und nahm mit der Zeit ab. Die Ursache für die antilisterielle Aktivität der beiden Floren bleibt unbekannt, ist aber nicht auf lösliche Hemmstoffe zurückzuführen. Darüber hinaus wurde der Einfluß der Reifungstemperatur auf die Biodiversität und die antilisterielle Aktivität in situ von komplexen undefinierten Rotschmiere Reifungskulturen untersucht. Dafür wurden Oberflächenfloren von ausgereiften Rotschmiere käsen der Molkereien R und K je zweimal entnommen (I und II). Jedes der vier Konsortien wurde zur Beimpfung von Weichkäse benutzt, welche bei zwei Temperaturen (13°C und 16/12°C) gereift wurden. Die Zusammensetzung der dabei erhaltenen Floren wurde im Schmierwasser und auch in der korrespondierenden Oberflächenflora der gereiften Käse am Ende der Versuche analysiert. Insgesamt wurden 1200 Isolate durch FT-IR Spektroskopie, sowie teilweise durch 16S rDNA Sequenzanalyse und durch klassische Methoden identifiziert. Außerdem wurde das antilisterielle Potential jedes Konsortiums für beide Temperaturabläufe bestimmt. Coryneforme Bakterien stellten 78% der Isolate. Soweit uns bekannt ist, ist dies der erste Bericht über das Vorkommen von Vagococcus carniphilus, Psychrobacter spp. und Marinobacter sp. in einer Schmierekäseflora. Weiterhin wurden die Coryneformen Brachybacteria tyrofermentans und Leucobacter komagatae zum ersten Mal für deutsche Schmierekäse beschrieben. Die Zusammensetzung der Floren RI und RII unterschieden sich beträchtlich. Bei der Reifungstemperatur von 13°C stieg in beiden Konsortien der Anteil der Coryneformen von etwa 82% im Schmierwasser auf etwa 96% der Isolate in der entsprechenden Oberflächenflora am Ende des Versuchs an. Bei einer Reifungstemperatur von 16/12°C dagegen wechselte der Anteil der Coryneformen nicht wesentlich. Hinsichtlich des Speziesanteils ergaben sich erhebliche Verschiebungen bei beiden Reifungstemperaturen. Im Fall der Konsortien K I und K II nahm der Coryneformenanteil bei beiden Reifungstemperaturen im Vergleich zum Schmierwasser ab. Im Fall von KII bei 16/12°C verloren die Coryneformen ihre Dominanz an Marinolactobacilli, welche im Schmierwasser vom K II nicht gefunden worden waren. Unabhängig von den Differenzen von K I und K II beim Schmierewasser hielt der Tend der Reduktion von A. nicotiana bei gleichzeitiger Zunahme von B. linens in beiden Konsortien bei einer Temperatur von 16/12°C an. Die antilisterielle Aktivität der Konsortien K I und KII hing offenbar von der Reifungstemperatur ab, während bei den Konsortien R I und R II kein Einfluss auf diese Eigenschaft festgestellt werden konnte. Als Schritt zu einem real time und in situ Monitoring von Pathogenen in kühlgelagerten Weichkäsen mit unveränderten Produkteigenschaften, wurden Biolumineszenzmutanten von Yersinia enterocolitica durch Transposon Mutagenese gewonnen. Hierfür wurde ein promotorloses, komplettes lux Operon (luxCDABE) von Photorhabdus luminescens verwendet. Die Lichtemission auf Käse wurde verfolgt. Die Mutante B49, welche das lux Operon in einem offenen Leserahmen unbekannter Funktion trug, wurde für das direkte Monitoring von Y. enterocolitica auf Käse verwendet, welcher bei 10°C gelagert wurde. Dabei wurde die Biolumineszenz mit einer Photonen zählenden ICCD (intensified charge coupled device) Kamera quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei 200 KBE/cm2. Mittels de s Promotors, den das lux operon durch Transposition erworben hatte, wurde die Biolumineszenz der Reportermutante durch Umweltbedingungen (NaCl, Temperatur, Käsematrix) signifikant reguliert, ebenso wie durch die Wachstumsphase. Die für niedrige Temperaturen häufig berichtete Abnahme der Photonen Emission älterer Zellen trat bei Mutante B49 nicht auf. Es war weder der Zusatz von Antibiotika, noch von Aldehyd zur Lebensmittelmatrix notwendig, um die Mutante stabil zu halten und um quantitative, reproduzierbare Biolumineszenzdaten zu erhalten.
Databáze: OpenAIRE
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