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The human brain is a highly complex structure consisting of billions of neurons and synapses, and to date it remains a challenge to uncover the neuronal processes underlying physiological and diseased states. Different imaging techniques have been developed, such as non-invasive magnetic resonance imaging (MRI) or high-resolution electron microscopy (EM) to study molecular processes in their biological context or to construct a connectome in order to obtain detailed anatomical information about the synaptic wiring with high resolution. However, these techniques require contrast agents to overcome inherent physical limitations, which poses a challenge in regards to, e.g., delivery and specificity. Although EM staining techniques are usually based on heavy metals, iron oxides can also yield electron-dense contrast in EM while also being suitable as contrast agents for MRI. Furthermore, large iron oxide particles consisting of magnetite have favorable properties enabling magnetic manipulations of biological systems, thus bridging the fields of imaging and manipulation. However, a genetically-controlled, induced magnetite formation was not achieved in aerobic organisms yet. The aim of this doctoral thesis was thus to develop and characterize different fully genetically encoded biological interfaces for MRI as well as EM, and to examine the controlled formation of magnetite in a biological context. To this end, different proteinaceous nano-compartments were expressed in mammalian cells and characterized in regards to their iron accumulation capability. The first part of this work focused on the ubiquitous, ferrihydrite-forming iron storage protein ferritin and the improvement of its magnetic properties to enable magnetic interactions with cells. While highly-magnetic, magnetite containing ferritin (magnetoferritin) has already been characterized, the magnetite core is obtained by in vitro synthesis, thus limiting the applicability of magnetoferritin as a genetically encoded interface. In this work, the possibility to transform naturally occurring ferrihydrite to magnetically more favorable magnetite was studied in detail both on uncoated particles and inside the ferritin protein shell. In addition, an accumulation of ferritin inside cellular lysosomal compartments was examined to test whether agglomeration effects can enhance the magnetic properties of ferrihydrite. The second part of this work concentrated on the characterization of a new, proteinaceous nano-compartment of bacterial origin: the encapsulin system of Quasibacillus thermotolerans (Qt) consisting of a shell protein and a self-sorting cargo. Encapsulins are bacterial nano-compartments involved in various metabolic processes, and some reportedly encapsulate ferroxidases as cargos, indicating a role in iron metabolism. The chosen encapsulin chosen is associated with a new type of ferroxidase, and both shell and cargo have been characterized in this work. Expression, self-assembly and cargo auto-targeting were demonstrated in E. coli and in mammalian cells. In addition, cryo-EM analysis was performed to gain in-depth structural information, which revealed that this encapsulin is the first to be reported with a triangulation number T = 4, thus making it the largest encapsulin known so far. In addition, the native Qt ferroxidase was demonstrated to have a superior iron sequestration capability in direct comparison to another encapsulin system as well as to ferritin, which highlights the suitability of iron-loaded Qt encapsulin as a contrast agent for magnetic resonance imaging. In addition, the Qt encapsulin was shown to be suitable as a fully genetically encoded electron microscopy contrast agent as it yielded electron-dense, clearly distinguishable particles in cellular TEM. Das menschliche Gehirn ist ein hochkomplexes System bestehend aus Milliarden von Neuronen und Synapsen, und bis heute ist es eine Herausforderung die neuronalen Prozesse zu entschlüsseln, die physiologischen und krankhaften Zuständen zugrunde liegen. Verschiedene bildgebende Verfahren wurden entwickelt, wie z.B. die nicht-invasive Magnetresonanztomographie (MRT) oder die hochauflösende Elektronenmikroskopie (EM), welche es ermöglichen molekulare Prozesse in ihrem biologischen Kontext zu untersuchen oder ein Konnektom zu konstruieren, um detaillierte anatomische Informationen über synaptische Verknüpfungen mit hoher Auflösung zu erhalten. Diese Techniken erfordern jedoch Kontrastmittel um zugrunde liegende physikalische Grenzen zu überwinden, wodurch sich Herausforderungen z.B. in Bezug auf die Verabreichung und Spezifität ergeben. Obwohl Färbemethoden für EM in der Regel auf Schwermetallen basieren, können Eisenoxide auch einen elektronendichten Kontrast in der Elektronenmikroskopie liefern und sind gleichzeitig auch als Kontrastmittel für MRT geeignet. Darüber hinaus verfügen große Eisenoxidpartikel aus Magnetit über vorteilhafte Eigenschaften, die magnetische Manipulationen biologischer Systeme ermöglichen. Eine genetisch kontrollierte, induzierte Magnetit-Bildung wurde bei aeroben Organismen jedoch noch nicht erreicht. Ziel dieser Doktorarbeit war es daher, verschiedene vollständig genetisch kodierte biologische Schnittstellen sowohl für MRT als auch für EM zu entwickeln und zu charakterisieren sowie die kontrollierte Magnetit-Bildung im biologischen Kontext zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene proteinhaltige Nanokompartimente in Säugetierzellen exprimiert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Eisenanreicherung charakterisiert. Der erste Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf das ubiquitäre, Ferrihydrit-bildende Eisenspeicherprotein Ferritin und die Verbesserung seiner magnetischen Eigenschaften, um magnetische Wechselwirkungen mit Zellen zu ermöglichen. Während hochmagnetisches, magnetithaltiges Ferritin (Magnetoferritin) bereits charakterisiert wurde, wird der Magnetitkern durch in vitro-Synthese gewonnen, was die Anwendbarkeit von Magnetoferritin als genetisch kodierte Schnittstelle einschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde sowohl an reinen Eisenpartikeln als auch an Ferritin untersucht, ob es möglich ist natürlich vorkommendes Ferrihydrit in magnetisch günstigeres Magnetit umzuwandeln. Darüber hinaus wurde eine Akkumulation von Ferritin innerhalb zellulärer lysosomaler Kompartimente untersucht, um zu testen, ob Agglomerationseffekte die magnetischen Eigenschaften von Ferrihydrit verbessern können. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Charakterisierung eines neuen, proteinartigen Nanokompartiments bakteriellen Ursprungs: das Encapsulin-System von Quasibacillus thermotolerans (Qt), das aus einem Hüllenprotein und einem selbst-sortierenden Cargo-Protein besteht. Encapsuline sind bakterielle Nanokompartimente, die an verschiedenen Stoffwechselprozessen beteiligt sind, und einige enthalten Ferroxidasen als Cargo-Protein was auf eine Rolle im Eisenstoffwechsel hinweist. Das gewählte Encapsulin ist mit einem neuen Typ von Ferroxidase assoziiert, und sowohl Hülle als auch Cargo wurden in dieser Arbeit charakterisiert. Expression, Selbstassemblierung und Cargo-Autotargeting wurden in E. coli und in Säugetierzellen nachgewiesen. Darüber hinaus wurde eine Kryo-EM-Analyse durchgeführt um detaillierte strukturelle Informationen zu gewinnen, die zeigten, dass diese Encapsulin das erste mit einer Triangulationszahl T = 4 ist und damit das größte bisher bekannte Encapsulin. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die native Qt-Ferroxidase im direkten Vergleich zu einem anderen Encapsulinsystem sowie zu Ferritin eine überlegene Fähigkeit zur Eisenspeicherung besitzt, was die Eignung von eisenbeladenem Qt Encapsulin als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie unterstreicht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Qt Encapsulin als vollständig genetisch kodiertes EM-Kontrastmittel geeignet ist, da es elektronendichte, klar unterscheidbare Partikel im zellulären TEM liefert. |
