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Die SecA Proteine aus Escherichia coli und Bacillus subtilis wurden mittels Negativkontrastierung elektronenmikroskopisch abgebildet und die Projektionen der Bildverarbeitung unterzogen. Das 3D-Modell von löslichem SecA aus E. coli zeigt ein offenes, globuläres Molekül (Durchmesser ca. 11 nm), während das SecA Protein aus B. subtilis (Durchmesser ca. 9 nm) kleiner und kompakter erscheint. Das elektronenmikroskopische Modell und das Röntgenstrukturmodell des B. subtilis SecA weisen bemerkenswerte Übereinstimmung auf. In Gegenwart von ADP liegt SecA aus E.coli in einer vergleichsweise kompakten Form vor, während die Zugabe von ATP bzw. AMP-PNP in einer offenen Konformation resultiert. Diese Befunde stehen mit spektroskopischen Messungen aus der Literatur im Einklang. Zur späteren Elektronenkristallographie wurden Versuche zur 2D-Kristallisation von SecA aus E. coli bzw. B. subtilis an geeigneten Lipid-Monoschichten durchgeführt und mittels Oberflächenspannungsmessungen und Brewster Winkel Mikroskopie (BAM) verfolgt. Während das SecA Protein aus B. subtilis an DOGS-NTA/Cu-Monoschichten dicht gepackte Strukturen bildete, konnten in elektronenmikroskopischen Untersuchungen keine 2D-kristalline Bereiche nachgewiesen werden. Die Technik der Negativkontrastierung in Kombination mit Bildverarbeitung wurde zur Lösung des Phasierungsproblems der Röntgenbeugungsdaten von Enoatreduktase aus Clostridium tyrobutyricum eingesetzt. Diese Vorgehensweise zeugt von der nützlichen Interaktion zwischen Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie zur Strukturuntersuchung von großen, oligomeren Proteinkomplexen, die bisher nur an wenigen Beispielen demonstriert wurde. Die strukturellen Veränderungen des E. coli GroE-Chaperon-Systems, das aus GroEL- und GroES-Einheiten besteht, nach Bindung des denaturierten Substratproteins Citratsynthase wurden elektronenmikroskopisch untersucht. Das aus Einzelpartikeln erstellte 3D-Modell zeigt sehr gute Übereinstimmung mit dem Röntgenmodell und deutet auf die Bindung des Substratproteins im Bereich der äquatorialen Domäne des freien GroEL-Rings. Negatively stained SecA proteins from Escherichia coli and Bacillus subtilis were visualised by transmission electron microscopy (TEM) and image processing. The 3D-model of soluble SecA from E. coli shows a open, globular molecule (diameter about 11 nm), whereas SecA from B. subtilis (diameter about 9 nm) is smaller and more compact. The SecA model from B. subtilis obtained by TEM and single particle analysis shows remarkable correspondence to the model derived from x-ray crystallography. In the presence of ADP, SecA from E. coli exhibits a comparable compact shape, whereas addition of ATP and AMP-PNP, respectively results in a more open conformation. These findings coincide with spectroscopic measurements from published results. Experiments for 2D-crystalisation of soluble SecA from E. coli respectively B. subtilis underneath suitable lipid monolayers were monitored with surface pressure measurements and brewster angle microscopy (BAM). SecA from B. subtilis formed densely packed structures, however, using TEM no 2D-crystaline areas could be visualised. Negative stain in combination with TEM and image processing was used to solve the phase problem of x-ray data from enoate reductase from Clostridium tyrobutyricum. This method is a example for the useful interaction between TEM and x-ray crystallography for structure determination of large, oligomeric protein complexes, which was demonstrated only in a few cases so far. Conformational changes of the E. coli GroE-chaperon system, which consists of several units of GroEL and GroES, induced by binding of the denaturated substrate protein citrat synthase were investigated by TEM. The 3D-model of GroE, derived from image processing of negatively stained single particles is in a good agreement with the 3D-model derived from x-ray crystallography, and suggests binding of citrat synthase in the aquatorial domain of the free GroEL ring. |
