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Die Biosynthese der Nichtstrukturproteine des Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) wurde hinsichtlich der Hierarchie und Dynamik der proteolytischen Reifung charakterisiert. Dabei wurden ein wildtypisches nicht-zytopathogenes Feldvirus sowie zwei zytopathogene Konstrukte untersucht, um einen Bezug zu beschriebenen Daten vom nahe verwandten BVDV zu ermöglichen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt: 1. Ein GST-NS2-3 Fusionsprotein, ein C-terminales Fragment der NS3-Helikase, ein C-terminales Fragment von NS4B und das vollständige NS5A des KSPV wurden in E. coli exprimiert und mittels Ni2+-Ionen Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Immunisierung von Versuchstieren erfolgte die Herstellung und Charakterisierung monoklonale Antikörper (mAbs) gegen diese Proteine. 2. Indirekte Immunfluoreszenz-Analysen zeigten eine enge Assoziation aller KSPV Nichtstrukturproteine mit den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. In Immunoblotanalysen eines zp KSPV Replikons und des nzp KSPV konnten die Vorläufermoleküle NS4-5 und NS2-3, die Prozessierungsintermediate NS5A/B, NS4B-5A und NS4A/B zusammen mit den reifen Nichtstrukturproteinen identifiziert werden. Außerdem zeigte sich eine zusätzliche interne Prozessierung des reifen NS3 zwischen der Protease- und Helikasedomäne des Moleküls. 3. In nzp KSPV, zp KSPV-JIV und dem zp KSPV Replikon wurde die Prozessierung der Nichtstrukturproteine mittel Immunpräzipitation und pulse chase Analysen dargestellt. Während der zp Biotyp des KSPV eine effiziente Generierung aller Nichtstrukturproteine zeigt, erfolgt die Reifung dieser Proteine im nzp Biotyp nur sehr langsam. Zum Vergleich der Biotypen wurden die Halbwertszeiten der Vorläufermoleküle und reifen Produkte bestimmt. In diesen Analysen erwiesen sich die reifen Proteine des KSPV als stabil (T1/2: 1,5-4 h). Im zp Biotyp werden die Vorläufermoleküle schneller umgesetzt (T1/2: 0,5-2,5 h) als die reifen Nichtstrukturproteine abgebaut werden, so dass die reifen Proteine in den Zellen akkumulieren. Dagegen erzeugt die langsame Reifung der Vorläufermoleküle im nzp Biotyp (T1/2: 2,5-5,5 h) eine konstante Menge an reifen Nichtstrukturproteinen in den infizierten Zellen. Diese Daten deuten erstmals darauf hin, dass die gesteigerte Expression von NS3 im zp Biotyp eines Pestivirus die Prozessierung der anderen Nichtstrukturproteine beschleunigt. Umgekehrt beschränkt die verminderte NS2-3 Spaltung in nzp Pestiviren die Aktivität der NS3 Protease und reguliert so die Konzentration der reifen Nichtstrukturproteine. The biosynthesis of Classical swine fever virus (CSFV) nonstructural proteins was characterized with regard to hierarchy and dynamics of proteolytic maturation. A wildtypic non-cytopathogenic isolate and two cytopathogenic CSFV constructs were analysed to allow the comparison with data about the closely related BVDV. The following results were achieved: 1 A GST-NS2-3 fusion protein, a C-terminal fragment of the NS3 helicase, a Cterminal fragment of NS4B, and the entire NS5A of CSFV were expressed in E. coli und purified by Ni2+ ion affinity chromatography. Following the immunization of laboratory animals, monoclonal antibodies (mAbs) against these proteins were produced and characterized. 2 Indirect immunofluorescence experiments showed a tight association of all CSFV nonstructural proteins with membranes of the endoplasmic reticulum. Immunoblot analyses of a cp CSFV replicon and ncp CSFV led to the identification of NS4-5 and NS2-3 precursors, NS5A/B and NS4A/B processing intermediates, and of all mature nonstructural proteins. In addition, a novel internal processing of NS3 was detected separating the protease and helicase domains of this molecule. 3 The nonstructural protein processing of ncp CSFV, cp CSFV-JIV, and a cp CSFV replicon was characterized by immunoprecipitation together with pulse chase analyses. The nonstructural protein maturation of the ncp biotype of CSFV occurs very slowly, while an efficient generation of all nonstructural proteins takes place in the cp biotype. Half-lives of precursors and mature proteins were determined to directly compare the different biotypes. These analyses showed that the mature nonstructural proteins of CSFV are stable (T1/2: 1,5-4 h). The maturation of precursor molecules was faster (T1/2: 0,5-2,5 h) than the turnover of mature products in the cp biotype. In contrast, a constant amount of mature proteins results from a slow maturation of precursor molecules in the ncp biotype (T1/2: 2,5-5,5 h). These data indicate that enhanced expression of NS3 in cp pestiviruses is responsible for an accelerated processing of the other nonstructural proteins. In contrast, inefficient NS2-3 cleavage in ncp pestiviruses restricts NS3 protease activity and thereby regulates the concentration of all mature nonstructural proteins. |
