Isolation of novel immunogenic protein carriers for vaccine development
| Autor: | Gomes, Marta Teresa da Silva |
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| Přispěvatelé: | Oliveira, Hugo Alexandre Mendes, Fraga, Alexandra Gabriel, Universidade do Minho |
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2022 |
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| Popis: | Dissertação de mestrado em Biotecnologia Os antibióticos têm sido amplamente usados no tratamento de infeções bacterianas, contudo o seu uso extensivo e indiscriminado tem levado ao aparecimento de organismos resistentes. Acinetobacter baumannii é uma bactéria multirresistente, regularmente encontrada em infeções nosocomiais, e foi indicada pela Organização Mundial da Saúde como prioritária no desenvolvimento de novas estratégias antimicrobianas. Dentro das alternativas, as vacinas surgem como abordagens de profilaxia. Assim, neste projeto pretende-se desenvolver uma nova pipeline para prever o potencial imunogénico de proteínas bacterianas, validar e aumentar o número de proteínas imunogénicas contra A. baumannii. Neste estudo, 21 proteínas de A. baumannii ATCC 17978 foram selecionadas através de ferramentas de vacinologia reversa e imunoinformática. Destas, as proteínas NlpE e BamE selecionadas e comparadas com a Omp33 com imunogenicidade comprovada. Expressão heteróloga recombinante sem os péptidos de sinal N-terminais resultou em proteínas solúveis, e análise por Dicroísmo Circular confirmou o seu enrolamento correto. In vivo, avaliamos a resposta imune contra estas proteínas em ratinhos Balb/c, após três inoculações. Ensaios de ELISA mostraram que todas as proteínas induziram síntese de anticorpos, e análises histológicas não revelaram sinais de patogenicidade. Adicionalmente, a compreensão dos mecanismos de virulência dos microrganismos é essencial para a evolução das terapias. Assim, surge a questão se proteínas envolvidas na virulência têm potencial imunogénico e vice-versa. Portanto, pretendeu-se também estudar o papel das proteínas Omp33, NlpE e BamE na virulência da bactéria, através da construção de mutantes de A. baumannii ATCC 17978 por CRISPR/Cas9. Ensaios de cinética de crescimento, formação de biofilme e sobrevivência em contato com soro humano mostraram que, apesar da menor cinética de crescimento dos mutantes, estes apresentam uma maior capacidade de formar biofilmes e não apresentam diferenças significativas na sobrevivência contra soro humano. Em suma, confirmamos que a combinação de ferramentas computacionais pode ser usada para previsão de proteínas imunogénicas. Neste trabalho, isolamos com sucesso duas novas proteínas com potencial de serem aplicadas em vacinas contra A. baumannii. Relativamente ao seu papel na virulência, ensaios adicionais mais específicos deverão ser realizados. Antibiotics have been successfully used to treat bacterial infections, yet its extensive and indiscriminate use has led to the appearance of resistant organisms. Acinetobacter baumannii is a multidrug-resistant bacterium, commonly found in nosocomial infections, which was listed by the World Health Organization as a priority in the development of new antimicrobial strategies. Among the alternatives, vaccines come as promising prophylactic approaches. Consequently, this project aims to create a new pipeline to predict the immunogenic potential of bacterial proteins, to validate and to expand the number of immunogenic proteins against A. baumannii. In this study, 21 A. baumannii ATCC 17978 proteins were selected as candidates using reverse vaccinology and immunoinformatic tools. From these, the NlpE and BamE were selected and compared with the outer membrane proteins Omp33 with proven immunogenicity. Heterologous recombinant expression without the N-terminal signal peptides resulted in soluble proteins, and Circular Dichroism ensured their proper folding. In vivo, we evaluated the immune response against these proteins in Balb/c mice, following three inoculations. ELISA assays with the mice’s sera showed that antibodies were synthesized against all proteins, and histology analysis revealed no signs of pathogenicity. Moreover, understanding the microorganism’s virulence factors is essential for the evolution of therapies. Thus, arises the hypothesis that virulence engaged proteins might have immunogenic potential and vice-versa. So, it was also intended to study the role of proteins Omp33, NlpE and BamE in the bacteria’s virulence, by constructing single-gene deletion mutants of A. baumannii ATCC 17978 using CRISPR/Cas9 genome edition. Growth kinetics, biofilm formation and survival in contact with human serum assays showed that, despite the lower growth kinetics of the mutants, they have an increased ability to form biofilms and show no significant differences in survival against human serum, compared to the wild-type strain. Overall, the results illustrate that the combination of computational tools and virulence associated analysis can be used to anticipate the proteins’ immunogenicity. Herein, we have successfully isolated two novel proteins with potential application in vaccines against A. baumannii. Regarding their role in virulence, more specific assays should be further performed. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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