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Most cancer-related chromosomal translocations appear to be cell type-specific. For example, the MYC-IGH translocation has always been reported and described in B-cells, and not in other type of cell. This may be due either to the cell type-specific spontaneous translocations between different loci or to the post-translocation selection of cells that have acquired selective survival advantages, such as enhanced growth and resistance to apoptosis. This observation was experimentally investigated by simultaneous induction of several double strand breaks (DSBs) at specific loci to generate specific chromosomal translocations in cells of different developmental origins: RPMI8866 (lymphoid, B-cell), Jurkat (lymphoid, T-cell), K562 (myeloid), MRC5 (lung fibroblast) and Hek-293 (embryonic kidney, epithelial). To this aim, an electrotransfection protocol was optimized to transfect cells, including hard-to-transfect cells such as B-cells, with Cas9- and gRNA-encoding plasmids. Four genes were targeted to comprise two 3-DSB sets: MYC-IGH-AML (MIA) and AML-ETO-IGH (AEI). Each cell type was induced of either one of the two 3-DSB sets utilizing the optimized electrotransfection protocol. The generated translocations were then measured using translocation-specific PCR primers in qPCR. The results showed the cell type-specific translocation frequencies after simultaneous induction of DSBs. The oncogenic MYC-IGH translocation had the highest frequency after DSB induction in MIA; while the previously unreported ETO-IGH translocation, not the oncogenic AML-ETO translocation, had the highest frequency after DSB induction in AEI. It was further shown that chromosomal translocations were generated regardless of the nuclear radial position, transcription activity and chromatin accessibility of the gene loci. Only the spatial proximity between the gene loci after DSB induction correlated with the resulting translocation frequency, supporting the “breakage-first” model of translocation formation. Furthermore, long term culture of cells with the generated chromosomal translocations for up to 60 days displayed varying survival outcomes in different cells. This indicated that cells acquire cell type-specific selective survival advantage from chromosomal translocations. Overall, the results demonstrate that chromosomal translocation can be generated after experimental DSB induction in almost any type of cell, but as to whether the cell with the translocation would persist depends on the cell type-specific selective survival advantage that the chromosomal translocation confers to the cell.; La plupart des translocations chromosomiques liées au cancer semblent être spécifiques d’un type cellulaire donné. Par exemple, la translocation MYC-IGH a toujours été rapportée et décrite dans les cellules B, et non dans d'autres types de cellules. Cela peut être dû soit aux translocations spontanées entre différents loci et qui sont spécifiques du type cellulaire, soit à la sélection post-translocation de cellules qui ont acquis un avantage sélectif de survie, tel qu'une croissance accrue ou une résistance à l'apoptose. Cette observation a été étudiée expérimentalement par induction simultanée de plusieurs cassures double brin (CDB) à des loci spécifiques pour générer des translocations chromosomiques spécifiques dans différents modèles cellulaires : RPMI8866 (lymphoïde, cellule B), Jurkat (lymphoïde, cellule T), K562 (myéloïde), MRC5 (fibroblaste pulmonaire) et Hek-293 (embryonnaire rénal, épithélial). À cet effet, un protocole d'électrotransfection a été optimisé pour transfecter ces cellules avec des plasmides codant pour la nucléase Cas9 et des ARN guides, y compris celles difficiles à transfecter telles que les cellules B. Quatre gènes ont été ciblés pour former deux combinaisons de 3-CDB chacune: MYC-IGH-AML (MIA) et AML-ETO-IGH (AEI). Dans chaque type cellulaire, l’une ou l’autre des combinaisons de 3-CDB a été induite en utilisant le protocole d'électrotransfection optimisé. Les translocations générées ont ensuite été mesurées par qPCR à l'aide d'amorces de PCR spécifiques à la translocation. Les résultats ont montré la fréquence des différentes translocations spécifiques pour chaque type de cellule après induction de CDB simultanées. Pour la combinaison MIA, la translocation oncogène MYC-IGH avait la fréquence la plus élevée après induction des CDB. Pour la combinaison AEI, la translocation ETO-IGH jamais décrite auparavant, et non la translocation oncogène AML-ETO, avait la fréquence la plus élevée après induction simultanée de CDB. Il a en outre été montré que des translocations chromosomiques étaient générées indépendamment de la position radiale nucléaire, de l'activité de transcription et de l'accessibilité de la chromatine des loci. Seule la proximité spatiale entre les loci après l'induction de la CDB était corrélée à la fréquence observée des translocations, soutenant le modèle du «breakage first» dans les mécanismes de formation des translocations. De plus, la culture à long terme jusqu’à 60 jours des cellules avec les translocations chromosomiques générées a montré une survie variable des différents types cellulaires. Ce qui suppose que l’avantage sélectif de survie acquis après la translocation est spécifique du type cellulaire. Dans l'ensemble, les résultats démontrent que les translocations chromosomiques peuvent être générées après induction expérimentale de CDB dans n'importe quel type de cellule, mais la persistance des cellules avec translocation dépend de l'avantage de survie sélectif que la translocation chromosomique confère à la cellule et qui est spécifique d’un type cellulaire. |
