大腸菌を用いたフォスファカン（コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）の融合コア蛋白の発現条件の検討
| Autor: | Ito, Sekiko, Okamoto, Motoi |
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| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 1996 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | 岡山大学医療技術短期大学部紀要. 6:63-72 |
| ISSN: | 0917-4494 |
| Popis: | Optimal conditions for expressing a specific region of core protein of phosphacan, a chondroitin sulfate proteoglycan known as receptor type protein tyrosine phosphatase, as fusion protein with glutathione S-transferase (GST) in E.coli were examined. DNA fragments inserted into the expression vector (pGEX-4T-1) were amplified by RT-PCR using mRNA purified from E18 rat brain as template. Primers attached with BamH I or EcoR I restriction site on 5' end were used to amplify first strand cDNA by PCR. Before ligation into the pGEX-4T-1 for GST fusion protein, PCR products were once cloned using T-A cloning system because they were not directly ligated into the pGEX-4T-1. E.coli strain BL21 was transformed by pGEX-4T-1 ligated with restriction DNA fragment cut out from pCR II plasmid vector of T-A clonig system. The growth of transformed BL21 was not different between the colony incubated at 37℃ for 24-48h and the colony stored at 4℃ for 7-10 days after 24h incubation at 37℃. The desirable OD(550) of culture medium for inducing the expression of fusion protein by isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) was from 0.6 to 1.0, because expression of native E.coli proteins per ml of culture medium was increased relatively when IPTG was added at OD(550) more than 1.0. The expression of fusion protein reached plateau around 6h after the induction. Relative expression of native E.coli proteins per ml of culture medium increased thereafter. Therefore, it may be desirable to purify the fusion protein around 6h after the induction. コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一種であるフォスフォアカンのコア蛋白の特異領域を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合蛋白として大腸菌内で発現させ、その発現条件の検討を行った。胎生18日目のラット脳から抽出したmRNAを鋳型として、RT－PCRによって増幅したDNAフラグメントを発現ベクターに挿入した。PCRの為のプライマーは、BamH IとEcoR Iの酵素消化部位を5'末端に組み込んだものを用いた。GST融合蛋白を作製するために、PCR産物を一旦、T-Aクローニングシステムに組込み、その後プラスミド精製と制限酵素消化によって目的のフラグメントを切り出した後、pGEXベクターに再度組み込ませ、大腸菌（BL21）を形質転換した。形質転換した大腸菌（BL21）について、24～48時間培養後に、37℃で保存したものと、37℃で24時間培養後に4℃で7～10日間保存したものとの増殖曲線を比較したところ、両者に有意な差は認められなかった。融合蛋白の誘導に必要なイソプロピルチオ－β－D－ガラクトシド（IPTG）の添加の時期は、菌培養液の吸光度（550nm）が1.0以上の場合には融合蛋白に比べて他の大腸菌固有の蛋白の割合が相対的に増大してしまう為、また、吸光度が0.6以下では菌量が少ない為、吸光度が0.6～1.0を示す時期に添加する方がより望ましいことがわかった。IPTGによる誘導後、融合蛋白の発現は6時間でプラトーに達し、その後は大腸菌固有の内在蛋白量の割合が相対的に増加した。以上の結果より、融合蛋白の発現を誘導するための至適条件は次のように決定された。1. IPTG誘導は、培養液の吸光度（550nm）が0.6～1.0の際に開始する。2. IPTGによる誘導時間は、6時間とする。 |
| Databáze: | OpenAIRE |
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