Selbstreplizierende nicht-virale Episomen (Minicircles): Expressionseigenschaften und Etablierung im Zellkern
| Autor: | Broll, Sandra |
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| Přispěvatelé: | Bode, Jürgen |
| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2009 |
| Předmět: | |
| DOI: | 10.24355/dbbs.084-200911160934-0 |
| Popis: | Nicht-virale episomal replizierende Vektorsysteme werden als sichere Alternative zu den bisher eingesetzten viralen Vektoren für die Gentherapie gesehen, da sie das Risiko der Insertionsmutagenese und immunogenen Reaktion des Wirtsorganismus umgehen. Der Prototyp eines solchen zirkulären, replizierenden Episoms, das Plasmid pEpi, basiert auf einer S/MAR (scaffold/matrix attachment region), die über ihre Affinität mit dem Kernmatrix-Protein SAF-A die stabile Replikation sowie die Segregation des Vektors bei der Zellteilung vermittelt. Die Etablierung des Episoms in der Zelle setzt allerdings einen initialen Selektionsdruck voraus. Zudem unterliegt pEpi in verschiedenen Zelltypen epigenetischen Inaktivierungsmechanismen, die zum Rückgang der Transgenexpression und, in teilenden Zellen, zu seinem Verlust führen. In dieser Arbeit wurde ein vielversprechender Lösungsansatz für diese Einschränkungen untersucht, nämlich die Entfernung der prokaryotischen Plasmidsequenzen einschließlich des Selektionsmarkers durch sequenzspezifische Rekombination in E. coli. Der daraus resultierende S/MAR-basierte DNA-Vektor stellt den ersten autonom replizierenden Minicircle zur Modifikation teilender Zellen dar. Er lässt sich in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien ohne Selektionsdruck etablieren und repliziert episomal. Ein S/MAR-internes Deletionsereignis führte zu der Entdeckung eines funktionellen Minimal-S/MAR-Elements, das die Stabilität des Minicircles und seine Transgenexpression weiter verbessert. Die Etablierungsrate S/MAR-basierter episomaler Vektoren hängt von den Gegebenheiten der Kernarchitektur ab und kann daher durch eine Auflockerung des Chromatins mittels Histon-Hyperacetylierung zum Zeitpunkt der Transfektion gesteigert werden. Non-viral episomal replicating vectors are considered to be a safe alternative to currently used viral vectors for gene therapy. They circumvent the risk of insertional mutagenesis and host immunogenicity. The prototype of such a circular replicating episome, the plasmid pEpi, is based on a S/MAR (scaffold/matrix attachment region) which provides maintenance functions and enables stable replication during cell division by its affinity to the nuclear matrix protein SAF-A. However, its establishment in the cell requires a selection agent. Furthermore, the episome is subject to gradual inactivation and vector loss from proliferating cells due to epigenetic defence mechanisms in several cell lines. In this thesis a promising approach for these limiting parameters is investigated. Using site-specific recombination the prokaryotic vector parts including the selection marker were excised in E.coli. The remaining novel S/MAR-based DNA vector represents the first example of an autonomous replicating minicircle for stable modification of dividing cells. It can be established in several eukaryotic cell lines in the absence of selection pressure and replicates episomally. An internal deletion of the S/MAR was noted leading to a functional minimal S/MAR that further improved stability and transgene expression of the minicircle. The rate of establishment of S/MAR-based episomal vectors depends on the nuclear architecture and therefore can be increased by decondensation of the cellular chromatin caused by histone hyperacetylation at time of transfection. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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