Alpha-Actinin regulates nuclear actin bundling and nuclear size in early G1
| Autor: | Krippner, Sylvia, Grosse, Robert (Prof. Dr.) |
|---|---|
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2020 |
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| DOI: | 10.17192/z2020.0173 |
| Popis: | Nuclear actin and its biological relevance raised much interest in the past few years. Although its existence was initially discussed controversially, more recent data provided insights into its functions and address stimuli as well as dynamics of nuclear actin filaments. Hence, our group recently showed that nuclear volume expansion in early G1 of mammalian cells required a network of transient and dynamic F-actin inside the daughter nuclei. However, only few regulatory pathways in nuclear F-actin formation were identified, while higher organization of actin filaments remained mostly uninvestigated. As such, the roles of actin crosslinking proteins were less well explored, but members of the spectrin repeat family were proposed to have nuclear functions. For instance, nucleocytoplasmic shuttling of the actin-bundling protein Alpha actinin-4 was associated with invasive cancer phenotypes. We therefore decided to investigate non-muscle Alpha actinins and their roles in early G1 nuclei. We initially confirmed cytoplasmic and nuclear localization of Alpha actinin-4 in interphase and early G1 cells and its interaction with nuclear F-actin by immunostaining and phalloidin pulldown experiments. Subcellular fractionations and subsequent Co-immunoprecipitations revealed the presence of Alpha actinin-1 SNAP Flag in the nuclear compartment. Imaging of histone 2B mCherry expressing cells during early G1 and following 3D reconstructions allowed for nuclear volume analysis and revealed that Alpha actinin-4, but not Alpha actinin-1 was required for proper nuclear volume expansion. We further visualized nuclear F-actin (bundles) in fixed postmitotic cells by super-resolution microscopy. Expression of a nuclear targeted dominant negative mutant of Alpha actinin-4 exhibited a significant reduction of phalloidin-AlexaFluor647 localizations per nucleus compared to the wild-type construct. These nuclei further represented fewer actin filament bundles with reduced widths, suggesting that Alpha actinin-4 is a key regulator of nuclear F-actin bundling and proper nuclear volume expansion in early G1. Further investigations revealed an additional involvement of nuclear Alpha actinin-4 in other cellular processes such as proliferation. Together, this work provides information about crucial functions of Alpha actinin-4 in the nuclear compartment of postmitotic mammalian cells and might therefore aid future investigations into its role for tumorigenesis and metastasis. In den letzten Jahren haben nukleäres Aktin und seine biologische Relevanz an Bedeutung gewonnen. Obwohl seine Existenz zunächst kontrovers diskutiert wurde, liefern aktuelle Studien nun Einblicke in dessen Funktion und beschäftigen sich mit den Stimulanzien sowie der Dynamik nukleärer Aktinfilamente. Unsere Gruppe hat dahingehend erst kürzlich gezeigt, dass die postmitotische nukleäre Volumenexpansion in Säugerzellen ein transientes und dynamisches Netzwerk aus Aktinfilamenten in den Tochterkernen erfordert. Für die Bildung nukleärer Aktinfilamente wurden nur wenige Regulationswege identifiziert, die Ausbildung höher organisierter Aktinfilamente bleibt sogar völlig unerforscht. Dementprechend ist nicht bekannt, welche Rolle jene Proteine spielen, die Aktinfilamente quervernetzen; Vertretern der Spectrin Repeat-Proteine werden jedoch Funktionen im Zellkern zugesprochen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Alpha Aktinin-4, durch die Fähigkeit vom Zytoplasma in den Kern zu pendeln und vice versa, mit invasiven Krebsphänotypen assoziiert ist. Daher entschieden wir uns, die nicht sarkomerischen Isoformen Alpha Aktinin-1 und Alpha Aktinin-4 und vor allem deren Funktionen in Zellkernen der frühen G1-Phase zu untersuchen. Wir konnten mit Hilfe von Immunfärbungen und Phalloidin-Pulldowns bestätigen, dass Alpha Aktinin-4 in Interphasekernen und ebenso in Kernen von postmitotischen Zellen vorkommt und dass es mit Aktinfilamenten interagiert. Subzelluläre Fraktionierungen und nachfolgende Ko-Immunpräzipitationen erlaubten es uns, Alpha Aktinin-1 SNAP Flag im nukleären Kompartiment nachzuweisen. Visualisierung von Histon 2B mCherry-exprimierenden Zellen während der frühen G1-Phase und anschließende 3D-Rekonstruktion der Zellkerne ermöglichten nukleäre Volumenanalysen. Diese offenbarten, dass Alpha Aktinin-4, nicht aber Alpha Aktinin-1, für die korrekte nukleäre Volumenexpansion nach der Mitose erforderlich war. Darüber hinaus visualisierten wir nukleäre Aktinfilamentbündel in fixierten postmitotischen Zellen mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie. Verglichen mit dem Alpha Aktinin-4 Wildtyp-Konstrukt, führte die Expression einer kernständigen dominant negativen Mutante des Alpha Aktinin-4 zu einer signifikanten Reduktion der Phalloidin-AlexaFluor647-Lokalisationen in den Tochterkernen. Außerdem wiesen diese Zellkerne weniger Aktinfilamentbündel mit jeweils verringerter Breite auf, was darauf hindeutet, dass Alpha Aktinin-4 einen wichtigen Regulator für die Ausbildung postmitotischer Aktinfilamentbündel und korrekte nukleäre Volumenexpansion in der frühen G1-Phase darstellt. Weitere Untersuchungen zeigten eine zusätzliche Beteiligung des Alpha Aktinin-4 an anderen zellulären Prozessen, wie etwa Proliferation. Alles in allem liefert diese Arbeit Informationen zu wichtigen Funktionen des Alpha Aktinin-4 im nukleären Kompartiment postmitotischer Säugerzellen und könnte daher helfen, dessen Rolle in Prozessen wie Tumorgenese und Metastasierung zu untersuchen. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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