Effect of titanium with nanotopography on the interaction between osteoblasts and osteoclasts
| Autor: | Rayana Longo Bighetti Trevisan |
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| Přispěvatelé: | Márcio Mateus Beloti, Emanuela Prado Ferraz, Gustavo Mendonça, Tarcilia Aparecida da Silva |
| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2022 |
| Zdroj: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP Universidade de São Paulo (USP) instacron:USP |
| Popis: | O processo de remodelação óssea, fundamental para a manutenção da osseointegração de implantes de titânio (Ti), compreende o equilíbrio entre a reabsorção de tecido ósseo por osteoclastos e a formação desse tecido por osteoblastos. Diversos estudos realizados por nosso grupo de pesquisa evidenciaram o papel da superfície de Ti com nanotopografia, obtida por condicionamento químico com solução de H2SO4/H2O2, na diferenciação osteoblástica, em diferentes condições. Entretanto, ainda não foram investigados os efeitos dessa superfície sobre a diferenciação e atividade osteoclásticas, e sobre a interação destas células com osteoblastos. Nesse contexto, nossa hipótese é que a nanotopografia, além de favorecer a diferenciação osteoblástica, é capaz de modular a diferenciação osteoclástica e a interação osteoblasto/osteoclasto. Assim, esse estudo teve como objetivo determinar a influência da superfície de Ti com nanotopografia (Ti Nano), comparada com a superfície de Ti usinada (Ti Controle), na interação entre osteoblastos e osteoclastos. Células pré-osteoblásticas (MC3T3- E1) e macrófagos (RAW 264.7) foram plaqueadas em ambas as superfícies de Ti e em insertos a 10.000 células/disco e cultivadas sob condições osteogênicas e osteoclastogênicas por 5 dias. No dia 5, os insertos contendo os osteoblastos foram posicionados nas culturas de osteoclastos e os insertos contendo osteoclastos foram posicionados nas culturas de osteoblastos, estabelecendo assim co-culturas indiretas, que foram mantidas por 2 dias. Os controles foram células não cocultivadas crescidas sobre ambas as superfícies de Ti. Ensaios com meio condicionado por osteoblastos crescidos sobre Ti Nano e Ti Controle, utilizados em culturas de osteoclastos cultivados sobre poliestireno também foram realizados, com a mesma densidade celular e intervalos de cultura. Os resultados referentes ao efeito de osteoclastos em osteoblastos crescidos sobre as diferentes superfícies demostraram, através de RNASeq (DESeq2: FC>1,7; p≤0,05) que os osteoclastos regulam negativamente a expressão de genes relacionados à osteogênese e regulam positivamente genes relacionados à modificação de histonas e organização da cromatina em osteoblastos cultivados em ambas as superfícies. Os osteoclastos também inibiram (p≤0,05) a expressão gênica e proteica de marcadores osteogênicos, e tal efeito foi reduzido pelo Ti Nano. Em relação ao mecanismo envolvido, observou-se aumento na expressão das proteínas H3K9me2, H3K27me3 e EZH2 em ambas as superfícies de Ti em condições de cocultura (p≤0,05). O ensaio ChIP revelou acúmulo de H3K9me2 reprimindo a região promotora de Alpl e H3K27me3 reprimindo Runx2, Alpl, Ibsp e Opg em osteoblastos na presença de osteoclastos, o que foi atenuado por Ti Nano. A imunofluorescência corroborou o ensaio ChIP, exibindo menos RUNX2 e ALP e mais H3K27me3 em osteoblastos em condições de co-cultura de forma menos pronunciada em Ti Nano. Os resultados referentes ao efeito de osteoblastos em osteoclastos crescidos sobre Ti Nano e Ti Controle e na presença de meio condicionado demostraram, através de análises de expressão gênica, que a nanotopografia favorece a diferenciação osteoclástica (p≤0,05), que foi potencializada pela presença dos osteoblastos, com aumento da expressão dos marcadores Rank, Ctsk, Tnf-α e da via de sinalização Rank/Rankl como cFos, Mitf, Nfatc1, e Traf6 (p≤0,05); entretanto, os osteoclastos apresentaram menor atividade, uma vez que houve diminuição da marcação de TRAP e da expressão das proteínas CTSK e TRAP, principalmente sobre Ti Nano na presença dos osteoblastos. Em conclusão, o Ti Nano pode favorecer resultados clínicos em termos de osseointegração de implantes, uma vez que a nanotopografia favorece a diferenciação osteoblástica, protege osteoblastos do efeito deletério de osteoclastos e modula a diferenciação osteoclástica, evidenciando um possível papel sobre o processo de remodelação óssea. Através desses achados, novas abordagens terapêuticas podem ser desenvolvidas, utilizando estratégias capazes de modular as atividades de osteoblastos e osteoclastos por diferentes nanotopografias, com objetivo de favorecer a interação entre biomateriais e o tecido ósseo. The bone remodeling process, essential for the maintenance of osseointegration of titanium (Ti) implants, comprises the balance between the resorption of bone tissue by osteoclasts and the formation by osteoblasts. Several studies developed by our research group demonstrated the role of the Ti surface with nanotopography, obtained by chemical conditioning with a H2SO4/H2O2 solution, in osteoblast differentiation under different conditions. However, the effects of this surface on osteoclast differentiation and activity, and their interaction with osteoblasts have not been investigated yet. In this context, our hypothesis is that nanotopography, in addition to favor osteoblast differentiation, is capable of modulating osteoclast differentiation and the osteoblast/osteoclast interaction. Thus, the aim of this study was to determine the influence of the Ti surface with nanotopography (Ti Nano), compared to the machined Ti surface (Ti Control), on the interaction between osteoblasts and osteoclasts. Pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1) and macrophages (RAW 264.7) were plated on both Ti surfaces and on inserts at 10,000 cells/disc or insert and cultured under osteogenic and osteoclastogenic conditions for 5 days. On day 5, inserts containing osteoblasts were placed in osteoclastic cultures and inserts containing osteoclasts were placed in osteoblastic cultures, thus establishing indirect co-cultures, which were maintained for 2 days. Controls were non-co-cultured cells grown on both Ti surfaces. Assays with conditioned media by osteoblasts grown on Ti Nano and Ti Control, used in osteoclast cultures grown on polystyrene were also performed, with the same cell density and time points. Regarding the effect of osteoclasts on osteoblasts grown on Ti surfaces, the RNASeq (DESeq2: FC>1.7; p≤0.05) evidenced that osteoclasts downregulated the expression of genes related to osteogenesis and upregulated genes related to histone modification and chromatin organization in osteoblasts cultured on both Ti Nano and Ti Control. Osteoclasts also inhibited (p≤0.05) gene and protein expression of osteogenic markers, and this effect was reduced by Ti Nano. Regarding the mechanism involved, an increase in the expression of H3K9me2, H3K27me3 and EZH2 proteins was observed on both Ti surfaces under co-culture conditions (p≤0.05). The ChIP assay revealed accumulation of H3K9me2 repressing the promoter region of Alpl and H3K27me3 repressing Runx2, Alpl, Ibsp and Opg in osteoblasts in the presence of osteoclasts, which was attenuated by Ti Nano. Immunofluorescence corroborated the ChIP assay, exhibiting less RUNX2 and ALP and more H3K27me3 staining in osteoblasts under co-culture conditions in a less pronounced way on Ti Nano. The results of the effect of osteoblasts on osteoclasts grown on Ti Nano and Ti Control and in the presence of conditioned medium showed, through gene expression analysis, that nanotopography favored osteoclast differentiation (p≤0.05), which was potentiated by the presence of osteoblasts, with an increased expression of markers such as Rank, Ctsk, Tnf-α and genes related to Rank/Rankl signaling pathway such as cFos, Mitf, Nfatc1, and Traf6 (p≤0.05); however, osteoclasts showed lower activity, as indicated by reduced TRAP staining and protein expression of CTSK and TRAP, mainly on Ti Nano in the presence of osteoblasts. In conclusion, Ti Nano may favor clinical results in terms of implants osseointegration, since nanotopography favors osteoblast differentiation, protects osteoblasts from the deleterious effect of osteoclasts and modulates osteoclast differentiation, evidencing a possible role in the bone remodeling process. Through these findings, new therapeutic approaches can be developed using strategies capable of modulating the activities of osteoblasts and osteoclasts by different nanotopographies, in order to favor the interaction between biomaterials and bone tissue. |
| Databáze: | OpenAIRE |
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