Aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen Tbtri5 de Trichoderma brevicompactum

Autor: Anamariela Tijerino Ayala
Přispěvatelé: Hermosa Prieto, María Rosa, Monte Vázquez, Enrique, Hermosa Prieto, Rosa, Monte Vazquez, Enrique
Rok vydání: 2010
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Zdroj: GREDOS. Repositorio Institucional de la Universidad de Salamanca
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Popis: [ES] Trichoderma brevicompactum es un hongo anamórfico descrito recientemente por Kraus y col. (2004) y, por tanto, es poco conocido. Sin embargo, dentro de las actividades biológicas descritas para esta especie destaca la antibiosis. En cuanto a la producción de metabolitos secundarios con actividad biológica en el clade Brevicompactum, se han descrito los trichotecenos como el harzianum A o la trichodermina. Estos trichotecenos se producen en la ruta biosintética de los terpeneos y su biosíntesis está regulada por factores genéticos y ambientales a nivel transcripcional. Se ha descrito que uno de los pasos críticos es la ciclación e isomerización de farnesil pirofosfato (FPP) a trichodieno (TDN), paso catalizado por la trichodieno sintasa, codificada por el gen tri5. A pesar que se han descrito genes similares de la ruta biosintética en Fusarium graminearum, es muy poco lo que se conoce de los genes de esta ruta en T. brevicompactum. La tesis doctoral está enfocada al aislamiento, caracterización y análisis funcional del gen Tbtri5 en T. brevicompactum IBT40841. Se aisló el gen tri5 utilizando sondas obtenidas a partir de Fusarium, para hibridar con una genoteca de DNA genómico de T. brevicompactum. Posteriormente, se obtuvieron transformantes sobreexpresando el gen Tbtri5. Se realizó el análisis funcional de Tbtri5 tanto en la cepa silvestre IBT40841, como en tres transformantes seleccionados por su actividad antibiótica. Por Southern se determinó una única copia endógena de Tbtri5 y una sola inserción del cassette de expresión en los transformantes. Bajo diferentes condiciones de cultivo y mediante estudios de Real Time PCR, se determinó una mayor expresión del gen en presencia de glucosa, glicerol y H2O2 y una represión en presencia de agentes antioxidantes como ácido ferúlico o tirosol. A partir de extractos acetónicos de cultivos de la cepa silvestre (IBT40841) y de uno de los transformantes; se purificaron por HPLC tres metabolitos: trichodermina, tirosol e hidroxitirosol, siendo éstos mayormente producidos por el transformante. En ensayos de actividad antimicrobiana (CLSI), se demostró que la trichodermina es el metabolito con capacidad antibiótica. La trichodermina fue capaz de inhibir el crecimiento de patógenos de importancia clínica como Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, P. aeruginosa, S. aureus MRSA, E. faecalis vancomicina resistente y A. baumannii. Además, se determinó que la trichodermina posee actividad antitumoral (mecanismo citostático) frente a adenocarcinoma de mama (MCF-7), carcinoma de pulmón (A-549) y carcinoma hepatocelular (Hep-3B y Hep-G2). Los resultados de los ensayos antitumorales indican que la trichodermina tiene menor actividad antitumoral, pero, a su vez, menor citotoxicidad frente a la línea hepatocelular humana sana que el taxol (paclitaxel), un antitumoral utilizado en el tratamiento de tumores sólidos. Por tanto, los resultados indican una relación del gen Tbtri5 de T. brevicompactum con las actividades anteriormente descritas. Por otro lado, análisis de tamaños y secuencias de productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de T. brevicompactum IBT40841 y de T. arundinaceum IBT40837 correspondientes a genes y regiones intergénicas del cluster tri, indican que la disposición de los genes es coincidente en ambas especies del género Trichoderma pero difiere con la descrita para el cluster tri en especies del género Fusarium. Además, a diferencia de lo que ocurre en Fusarium, en las dos cepas de Trichoderma el gen Tbtri5 está situado fuera del cluster tri. Finalmente, la aplicación biotecnológica de T. brevicompactum podría residir en la explotación de las capacidades antimicrobiana y antitumorales de la trichodermina. Precisamente, a diferencia de otras especies del género Trichoderma, éstas capacidades invalidan a T. brevicompactum como agente de control biológico.
[EN] Trichoderma is a fungus anamorphic brevicompactum recently described by Kraus et al. (2004) and, therefore, is little known. However, within the biological activities described for this species highlights the antibiosis. As for the production of secondary metabolites with biological activity in the clade brevicompactum, trichotecenos have been described as A or trichodermina harzianum. These trichotecenos occur in the biosynthetic pathway of terpeneos and its biosynthesis is regulated by genetic and environmental factors at the transcriptional level. It has been reported that one of the critical steps is the cyclization and isomerization of farnesyl pyrophosphate (FPP) to trichodieno (TDN), trichodieno step catalyzed by synthase, encoded by the gene tri5. Although similar genes have been described in the biosynthetic pathway in Fusarium graminearum, very little is known about the genes of this pathway in T. brevicompactum. The dissertation is focused on the isolation, characterization and functional analysis of the gene in T. Tbtri5 brevicompactum IBT40841. Tri5 gene was isolated using probes derived from Fusarium, to hybridize with a library of genomic DNA from T. brevicompactum. Subsequently, transformants were obtained by overexpressing the gene Tbtri5. We performed functional analysis of both Tbtri5 IBT40841 wild type, as in three transformants selected by their antibiotic activity. Southern was determined by a single copy endogenous Tbtri5 and a single insertion of expression cassette in the transformants. Under different culture conditions and by Real Time PCR studies, we found a greater expression of the gene in the presence of glucose, glycerol and H2O2 and repression in the presence of antioxidants such as ferulic acid and tyrosol. From acetone extracts of cultures of wild type (IBT40841) and one of the transformants, were purified by HPLC three metabolites: trichodermina, tyrosol and hydroxytyrosol, the latter being mostly produced by the transformant. In tests of antimicrobial activity (CLSI) demonstrated that the metabolite trichodermina antibiotic capacity. The trichodermina was able to inhibit the growth of clinically important pathogens such as Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, P. aeruginosa, S. aureus MRSA, E. A. faecalis and vancomycin-resistant baumannii. It was concluded that the trichodermina has antitumor activity (cytostatic mechanism) against breast adenocarcinoma (MCF-7), lung carcinoma (A-549) and hepatocellular carcinoma (Hep-3B and Hep-G2). The test results indicate that trichodermina tumor has lower antitumor activity, but, in turn, lower cytotoxicity against human hepatocellular line healthy Taxol (paclitaxel), an antitumor used in the treatment of solid tumors. Therefore, the results indicate a relationship between gene Tbtri5 T. brevicompactum with the above activities. On the other hand, size and sequence analysis of PCR products amplified from genomic DNA of T. brevicompactum IBT40841 and T. IBT40837 arundinaceum for genes and intergenic regions of the tri cluster indicate that the arrangement of genes is consistent in both species of the genus Trichoderma, but differs from the tri cluster described for Fusarium species. Moreover, unlike what happens in Fusarium, in the two strains of Trichoderma Tbtri5 gene cluster is located outside the tri. Finally, the biotechnological application of T. brevicompactum may lie in exploiting the capabilities of the antimicrobial and antitumor trichodermina. Indeed, unlike other species of Trichoderma, T. invalidate these capabilities brevicompactum biological control agent.
Databáze: OpenAIRE
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