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SUMMARY Ca2+-dependent regulated exocytosis is major form of exocytosis in neurons and neuroendocrine cells. These cells release neurotransmitters and hormones through exocytosis of secretory vesicles upon external stimuli. Regulated exocytosis occurs in different stages: biogenesis of the secretory vesicles, translocation of these vesicles, that are targeted and docked to the plasma membrane (PM). Ultimately when the Ca2+ concentration strongly increases, fusion of secretory vesicles with the PM occurs inducing release of the neurotransmitter cargo outside the cells. In the last 30 years, adrenal medullary chromaffin cells have emerged as a model system to study regulated secretory pathway because they are round, rendering them easy to patch and because they can be used for membrane capacitance measurements. Furthermore, due to their common origin with the sympathetic neurons their molecular machinery for regulated secretion is very similar to that found in neurons. Even though chromaffin cells are extensively used to study the regulated secretory pathway, biogenesis and recycling of the chromaffin secretory granules which are called large dense core vesicles (LDCVs) still remains unresolved. In order to get more insights into these processes, I used adrenal chromaffin cells from newborn mice and successfully electroporated them with Neuropeptide Y (NPY)-mCherry fusion protein construct to specifically label the newly generated LDCVs. I followed them by fixing the chromaffin cells at different time intervals from 2 h to 24 h post transfection. Immunostaining of the cis-Golgi compartment and the cortical actin network was used to analyze the distribution of the newly formed vesicles over time. I could show that initial expression of NPY-mCherry was already visible after 2 h post transfection but it was localized near Golgi and that few vesicles were formed. Over the time LDCVs moved away from the Golgi and distributed in the cytoplasm. LDCVs accumulated in the cortical actin ring but not directly adjacent to the PM. Furthermore, there was only partial colocalization between NPY and the cis- or trans-Golgi markers irrespective of the time used to study colocalization. With the help of correlative fluorescence electron microscopy (CLEM), we could show that the non-overlapping area near the Golgi, which was neither cis- nor trans-Golgi, was indeed another Golgi compartment. The identification of this compartment remains to be elucidated. I was also able to show that the vesicular proteins Synaptobrevin-2 (Syb-2), Cellubrevin (Ceb), and Synaptotagmin1 (Syt1) gets associated with the newly generated LDCVs at a later stage in the biogenesis because their colocalization with NPY-mCherry increased over time and was highest at 24 h post transfection. Moreover, I also studied the endocytosis of Syt1 in NPY-mCherry transfected chromaffin cells by inducing exocytosis followed by endocytosis with application of 60mM KCl, allowing the uptake of lumenal domain anti-Syt1 antibody, and fixing the cells at increasing time of recovery. I also used anti-TGN38 and anti-Rab11A antibodies to study the fate of the endocytosed Syt1. I counted the number of Syt1 punctae overlapping with NPY-mCherry after stimulation and the number of Syt1 punctae remaining at the cell periphery. We observed that Syt1 required a minimum of 2 h for recycling, and this recycling was not mediated by Rab11A positive endosomes because the number of punctae positive for endocytosed Syt1 and Rab11A were scarce. The three major conclusions from this study were: 1. Generation of vesicles needs at least 2 h and a new Golgi compartment devoid of GM130 and TGN38 retains the expression of NPY-mCherry probably for loading of vesicles with neuropeptides and Granins. 2. Association of vesicular membrane proteins with the newly formed vesicles happens at late stage in biogenesis. 3. Recycling of Syt1 needs a minimum of 2 h after first round of exo/endocytosis and it is not dependent on Rab11A positive endosomes. Our group previously showed that dead-end vesicles which remain attached at the PM for a long time without fusing exist in bovine chromaffin cells. We demonstrated that target-Soluble NSF Attachment Protein Receptors (t-SNAREs) mediates dead-end docking via formation of unproductive t-SNARE acceptor complexes that hinders the fusion of docked vesicles with the PM. However, the vesicular component interacting with the unproductive t-SNARE acceptor complexes remained unknown. We used knock out mouse models for different vesicular proteins like Syb-2, Ceb, Syt1, and Syt7. I perfused the mouse chromaffin cells with high free Ca2+ and used the combination of membrane capacitance measurement through patch-clamp technique and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) allowing the analysis of single vesicle fusion and of their behavior during the recording period. First I was able to show that dead-end vesicles also existed in mouse chromaffin cells. Then I analyzed the effect of the absence of the above cited vesicular proteins on dead-end docking. Syb-2 KO induced significant reduction in global secretion but no effect on the number of dead-end vesicles. Also, there was no docking defect in Syb-2 KO cells. Ceb KO showed no effect on any of the TIRFM parameters and no effect on overall secretion. Syt1 KO cells showed strong docking defect and a high reduction in single vesicle secretion in comparison to control. However, no influence on overall exocytosis or number of dead-end vesicles was found. Syt7 KO cells also showed mild but significant docking defect and strong decrease in number of vesicles that were secreted in TIRF in comparison to WT control. Surprisingly, there was also a massive decline in the number of dead-end vesicles. The specificity of the effect of Syt7 on dead-end docking was further tested by overexpressing Syt7 in Syt7 KO, which rescued the number of dead-end vesicles. From this study, I concluded that: 1. Dead-end vesicles also exist in mouse chromaffin cells. 2. v-SNAREs have no role in dead-end docking. 3. Syt1 has an important role in productive docking but not in dead-end docking. 4. Syt7 is the only vesicular protein to be involved in unproductive docking. ZUSAMMENFASSUNG Ca2+-abhängige regulierte Exozytose ist die Hauptform der Exozytose in Neuronen und neuroendokrinen Zellen. Diese Zellen setzen Neurotransmitter und Hormone durch Exozytose von sekretorischen Vesikeln auf entsprechende Stimuli hin frei. Die regulierte Exozytose erfolgt in verschiedenen Stadien: Biogenese der sekretorischen Vesikel, Translokation dieser Vesikel, zur Plasmamembran (PM) und “Andocken” dieser Vesikel mit der PM. Nach einem Ansteig der intrazellulären Ca2+-Konzentration erfolgt die Fusion von sekretorischen Vesikeln mit der PM ein, die zur Freisetzung der Neurotransmitter-Ladung führt. In den letzten 30 Jahren sind Chromaffin-Zellen des Nebennierenmarks als Modellsystem etabliert worden, um den regulierten sekretorischen Weg zu untersuchen. Dies hat verschiedene Gründe: zum einen sind Chromaffine Zellen rund, was sie leicht zu patchen und was für Membrankapazitätsmessungen sehr nützlich macht. Darüber hinaus ist aufgrund ihrer gemeinsamen Herkunft mit den sympathischen Neuronen aus der Neuralleiste ihre molekulare Maschinerie für regulierte Sekretion sehr ähnlich wie bei Neuronen. Obwohl Chromaffin-Zellen weitgehend verwendet werden, um den regulierten sekretorischen Weg zu untersuchen, bleibt die Biogenese und das Recycling der chromaffinen Sekretionsgranula, die hier als große dichte Kern-Vesikel (large dense core vesicles, LDCVs) bezeichnet werden, noch ungelöst. Um mehr Einblicke in diese Prozesse zu erhalten, benutzte ich adrenale Chromaffin-Zellen der Nebenniere von neugeborenen Mäusen und transfizierte sie erfolgreich mit einem Neuropeptid Y (NPY)-mCherry-Fusionsprotein-Konstrukt, um die neu erzeugten LDCVs spezifisch zu markieren. Ich untersuchte die Biogenese der chromaffinen Granula, indem ich die Chromaffinzellen in verschiedenen Zeitintervallen von 2 h bis 24 h nach der Transfektion fixierte. Die Immunfärbung des cis-Golgi-Kompartiments und des kortikalen Aktin-Netzwerks wurde verwendet, um die Verteilung der neu gebildeten Vesikel im Laufe der Zeit zu analysieren. Ich konnte zeigen, dass eine erste Expression von NPY-mCherry bereits 2 h nach der Transfektion sichtbar war. Die Expression 2 h nach der Transfektion war aber in der Nähe von Golgi beschränkt und es wurden nur wenige Vesikel zu diesem Zeitpunkt gebildet. Im Laufe der Zeit entfernten sich die LDCVs vom Golgi und verteilten sich im Zytoplasma. LDCVs sammelten sich im kortikalen Aktinring an, aber nicht direkt neben der PM. Darüber hinaus gab es nur eine partielle Kolokalisierung zwischen NPY und den cis- oder trans-Golgi-Markern. Mit Hilfe der korrelativen Fluoreszenz-Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir zeigen, dass die nicht überlappende Fläche in der Nähe des Golgi, die weder cis- noch trans-Golgi war, tatsächlich ein weiteres Golgi-Kompartiment darstellte. Die Identifizierung dieses unbekannten Golgi-Kompartimentes bleibt abzuklären. Ich konnte auch zeigen, dass die vesikulären Proteine Synaptobrevin-2 (Syb-2), Cellubrevin (Ceb) und Synaptotagmin1 (Syt1) mit den neu erzeugten LDCVs in einem späteren Stadium der Biogenese assoziiert werden, weil ihre Kolokalisation mit NPY-mCherry erste im Laufe der Zeit sich erhöhte und am höchsten 24 h nach der Transfektion war. Darüber hinaus habe ich auch die Endozytose von Syt1 in NPY-mCherry-transfizierten Chromaffin-Zellen untersucht. Dazu habe ich zunächst mittels einer Applikation von 60 mM KCl eine Exozytose induziert, gefolgt von einer Endozytose, was die Aufnahme von luminalen Domänen-Anti-Syt1-Antikörpern ermöglicht und die Zellen nach unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert. Ich habe u.a. Anti-TGN38 und Anti-Rab11A-Antikörper verwendet, um das Schicksal des endozytosierten Syt1 zu untersuchen. Ich zählte die Anzahl der Syt1 Punkte, die mit NPY-mCherry nach der Stimulation überlappten, und die Anzahl der Syt1 Punkte, die an der Zellperipherie verbleiben. Wir beobachteten, dass Syt1 mindestens 2 h für das Recycling benötigte, und dieses Recycling nicht durch Rab11A positive Endosomen vermittelt wurde, da die Anzahl der Punkte, die sowohl für endozytierte Syt1 als auch für Rab11A positive waren, gering war. Die drei wichtigsten Schlussfolgerungen aus dieser Studie waren: 1. Die Erzeugung von Vesikeln (LDCVs) benötigt mindestens 2 h und benötigt ein neues Golgi-Kompartiment, das weder GM130 noch TGN38 aufweist, und wahrscheinlich für die Beladung von Vesikeln mit Neuropeptiden und Graninen zuständig ist. 2. Die Verknüpfung von vesikulären Membranproteinen mit den neu gebildeten Vesikeln erfolgt im späten Stadium der Biogenese. 3. Recycling von Syt1 braucht mindestens 2 Stunden nach der ersten Runde der Exo / Endozytose und ist nicht abhängig von Rab11A positiven Endosomen. Unsere Gruppe zeigte zuvor, dass sogenannte “dead-end” Vesikel, die an der PM lange haften bleiben, ohne zu fusionieren, auch in Rinder-Chromaffin-Zellen vorhanden sind. Wir haben gezeigt, dass sogenannte target-Soluble NSF Attachment Protein Receptors (t-SNAREs) das dead-end Docking durch Bildung von unproduktiven t-SNARE-Akzeptorkomplexen vermitteln, die die Verschmelzung von angedockten Vesikeln mit der PM behindern. Die vesikuläre Komponente, die mit den unproduktiven t-SNARE-Akzeptorkomplexen interagiert, blieb jedoch unbekannt. Wir verwendeten Knock out Maus Modelle für verschiedene vesikuläre Proteine wie Syb-2, Ceb, Syt1 und Syt7. Ich habe die Maus-Chromaffin-Zellen mit hohen Konzentrationen von freiem Ca2+ perfundiert und die Kombination der Membrankapazitätsmessung durch Patch-Clamp-Technik und Total-Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) verwendet, um die Analyse der Einzelvesikelfusion und ihres Verhaltens während der Aufzeichnungsperiode zu ermöglichen. Zuerst konnte ich zeigen, dass dead-end Vesikel auch in Maus-Chromaffin-Zellen existierten. Dann analysierte ich die Wirkung der Abwesenheit der oben genannten vesikulären Proteine auf dead-end Docking. Syb-2 KO induzierte eine signifikante Reduktion der globalen Sekretion, aber keine Wirkung auf die Anzahl der dead-end Vesikel. Auch gab es keinen Docking-Defekt in Syb-2 KO-Zellen. Ceb KO zeigte keine Wirkung auf einen der TIRFM-Parameter und keine Auswirkung auf die Gesamtsekretion. Syt1-KO-Zellen zeigten einen starken Docking-Defekt und eine hohe Reduktion der Einzel-Vesikel-Sekretion im Vergleich zur Kontrolle. Es wurde jedoch kein Einfluss auf die Gesamt-Exozytose oder die Anzahl der dead-end Vesikel festgestellt. Syt7-KO-Zellen zeigten auch einen leichten, aber signifikanten Docking-Defekt und eine starke Abnahme der Anzahl von Vesikeln, die im Vergleich zur WT-Kontrolle in TIRF sezerniert wurden. Überraschenderweise gab es auch einen massiven Rückgang der Anzahl der dead-end Vesikel. Die Spezifität der Wirkung von Syt7 auf dead-end Docking wurde weiter durch Überexpression von Syt7 in Syt7 KO, die die Anzahl der dead-end Vesikel wieder herstellt getestet. Aus dieser Studie kam ich zu folgenden Schlussfolgerungen: 1. Dead-End-Vesikel gibt es auch in Maus-Chromaffin-Zellen. 2. v-SNAREs haben keine Rolle im dead-end Docking. 3. Syt1 hat eine wichtige Rolle bei der produktiven Andockung, aber nicht bei dead-end Docking. 4. Syt7 ist das einzige vesikuläre Protein, das sowohl in unproduktives Docking involviert ist. |
