A Reliable Protocol for In situ microRNAs Detection in Feeding Sites Induced by Root-Knot Nematodes
| Autor: | Janice de Almeida-Engler, Fernando E. Díaz-Manzano, Gilbert Engler, Marta Barcala, Carolina Escobar, Carmen Fenoll |
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| Rok vydání: | 2016 |
| Předmět: |
0106 biological sciences
0301 basic medicine In situ Nematodes In situ microRNAs In situ hybridization Plant Science Biology tomato 01 natural sciences Tomato 03 medical and health sciences Galls giant cells Arabidopsis microRNA Botany Gall miR390 Syncytium in situ microRNAs Plant roots food and beverages Meloidogyne spp biology.organism_classification Giant cells Cell biology 030104 developmental biology Giant cell nematodes galls Protocols 010606 plant biology & botany |
| Zdroj: | Frontiers in Plant Science RUIdeRA. Repositorio Institucional de la UCLM instname |
| ISSN: | 1664-462X |
| Popis: | Las agallas inducidas por Meloidogyne spp. en las raíces de las plantas son un órgano complejo formado por tejidos heterogéneos; dentro de ellas, existen 5-8 células gigantes (GCs) que los nematodos utilizan para su propia nutrición. Los mecanismos de regulación son sutiles y es probable que medie la represión masiva de genes descritos en las etapas tempranas de la infección en las agallas, particularmente en las células gigantes. Algunos de estos mecanismos están mediados por microRNAs; por lo tanto, se describe un protocolo fiable para detectar la abundancia de microRNAs dentro de los tejidos de las agallas inducidas por Meloidogyne spp. Algunos métodos están disponibles para determinar la abundancia de microRNAs específicos en diferentes partes de la planta; sin embargo, no en agallas que son órganos complejos formados por diferentes tejidos. Por lo tanto, la detección de microRNAs a nivel celular es particularmente importante para entender los mecanismos de regulación específicos que operan dentro de las GCs. La hibridación in situ (ISH) es un método clásico, robusto y preciso que permite la localización de los ARN específicos directamente en los tejidos vegetales. Presentamos por primera vez un método de ISH adaptado y estandarizado para detectar microRNAs en GCs inducidos por nematodos basados en parafina e ISH de microRNAs. Además, se puede adaptar a cualquier laboratorio sin más requisitos que un microtomo y un microscopio óptico y se tarda diez días para llevar a cabo, una vez el material vegetal se haya recogido. La técnica mostrada es muy fiable y de gran valor para una rápida detección de los patrones de expresión de microRNAs en tomate. Hemos probado el protocolo para el microRNA 390 ya que el análisis de secuenciación masiva mostró que éste microRNA se indujo a 3 dpi (días después de la infección) en agallas de Arabidopsis y está 100% conservado entre Arabidopsis y tomate. La localización exitosa del microRNA 390 en GCs de tomate constituye una validación de este método que podría extenderse fácilmente a otros cultivos y / o sincitios inducidos por otros nematodos (formadores de quistes). Por último, también se incluye una orientación sobre la solución de problemas que pueden surgir durante el proceso. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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