Searching for potential cis-regulatory elements of Dact1 gene in mouse (Mus musculus) preadipocyte

Autor: Fernanda Cristina da Veiga
Přispěvatelé: Alvares, Lucia Elvira, 1968, Mori, Marcelo Alves, Carvalho, Carolina Prado de França, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Rok vydání: 2016
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: Lúcia Elvira Alvares Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os genes da família Dact codificam proteínas multifuncionais que desempenham importantes funções na embriogênese e na manutenção da homeostase pós-natal. Em particular, estas proteínas são importantes moduladoras das vias de sinalização Wnt e TGF-?, sendo requeridas para regular os níveis de sinalização parácrina em diferentes contextos celulares, maximizando a eficiência de vários processos biológicos. Estudos recentes associaram ao gene Dact1 a capacidade de modular a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos maduros, demonstrando a grande plasticidade deste gene. Isto posto, uma nova perspectiva se abre em relação ao mecanismo molecular que pode estar agindo sobre a transcrição desse gene no tecido adiposo branco. Neste trabalho foi identificada uma ECR (do inglês, Evolutionary Conserved Region) que potencialmente exerce um papel regulatório na expressão de Dact1, podendo coordenar temporal e espacialmente sua ação. A partir desta abordagem, esta pesquisa aprofundou o conhecimento sobre a ação dessa ECR no contexto da adipogênese, tendo como técnicas análises de Bioinformática, clonagem de fragmentos de DNA genômico, construção de vetores de expressão, análise de expressão gênica por RT-PCR e análise funcional em cultura de células pré-adipogênicas 3T3-L1. Os resultados mostraram que, de fato, o gene Dact1 está sendo transcrito nos pré-adipócitos em estado proliferativo e também durante a indução da diferenciação em células 3T3-L1, assegurando que o aprofundamento no entendimento da regulação deste gene no contexto da adipogênese se faz pertinente e necessário. Neste trabalho também foi analisada a conservação desta ECR entre os vertebrados, identificando os principais polimorfismos presentes nos sítios de ligação para fatores de transcrição presentes nesta região e que são conservados entre diferentes ordens de mamíferos e aves. Ademais, as análises de Bioinformática apontaram que o gene Dact1 pode ser modulado por esta ECR durante a adipogênese, pois apresenta, nesta região, sítios de ligação altamente conservados entre aves e mamíferos para os fatores de transcrição PPAR? e SMADs, personagens centrais do processo adipogênico. Além disso, as análises dos dados de ChIP-Seq do banco de dados da UCSC mostraram que este provável elemento cis-regulador deve agir em outros contextos celulares nos camundongos, como cardiomiócitos e hepatócitos. Ensaios de eletroporação de células 3T3-L1 com construções de expressão contendo a ECR regulando a atividade dos genes-repórter eGFP e Luciferase foram realizados para testar a funcionalidade deste elemento genômico em pré-adipócitos. Os resultados obtidos mostraram que há uma alteração na expressão dos genes-repórter, indicando que esta ECR deve estar sendo induzida neste contexto celular. Estudos adicionais serão importantes para elucidar o mecanismo pelo qual esta região genômica é ativada Abstract: he Dact family genes encode multifunctional proteins that play important roles in embryogenesis and in the maintenance of postnatal homeostasis. In particular, these proteins are important modulators of Wnt and TGF-? signaling pathways, since they are required to regulate the levels of paracrine signaling in different cellular contexts, maximizing the efficiency of many biological processes. Recent studies have assigned to Dact1 gene the ability to modulate the differentiation of preadipocytes into mature adipocytes, demonstrating the great plasticity of this gene. This finding opens a new perspective in relation to the molecular mechanism that may be acting on the transcription of this gene in white adipose tissue. In this work we identified an ECR (Evolutionary Conserved Region) that potentially plays a regulatory role in Dact1 expression, and can coordinate its action both temporally and spatially. From this approach, this research deepened the understanding of the possible roles of this ECR in the context of adipogenesis, using Bioinformatics tools, cloning genomic DNA fragments, constructing expression vectors, analyzing gene expression by RT-PCR, and performing functional assays in cultured 3T3-L1 cells. The results showed that, in fact, Dact1 is being transcribed in preadipocytes in proliferative state and during the induction of differentiation in 3T3-L1 preadipogenic cells, ensuring that the deepening in understanding the regulation of this gene in the context of adipogenesis is made relevant and necessary. In this study we also analyzed the ECR conservation among vertebrates, identifying polymorphisms in major transcription factors binding sites present in this region that are conserved among different orders of mammals and birds. Furthermore, the Bioinformatics analysis showed that Dact1 could be modulated by this ECR during adipogenesis, as it has in this region binding sites highly conserved between birds and mammals for the transcription factors PPAR? and SMADs, central characters in the adipogenic process. Additionally, studies based on ChIP-Seq data from the UCSC database showed that this putative cis-regulatory element should act on other cellular contexts in mice, as in heart and liver cells. Electroporation assays in 3T3-L1 cells using expression constructs containing the ECR regulating the activity of the reporter gene eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) and Luciferase were conducted to test the functionality of this genomic element in preadipocytes. The results showed that there is a change in the reporter gene expression, indicating that this ECR is being induced in this cellular context. Additional studies will be important to elucidate the mechanism by which this genomic region is activated Mestrado Biologia Tecidual Mestra em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 131251/2014-7
Databáze: OpenAIRE
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