The Drosophila Nephrocyte - Modeling Podocyte Function and Disease

Autor: Hochapfel, Florian
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2019
Předmět:
Popis: In modern industrialized nations, chronic non-communicable diseases have become the main reason of mortality. During the last years, the global health burden of chronic kidney diseases (CKD) has grown considerably and in many of these cases, no targeted or personalized therapies are available. To keep up with the rising challenges, the understanding of the causes and mechanisms underlying CKD needs to be improved and novel approaches must be found and refined to support and enrich conventional research methods. This dissertation encompasses four manuscripts concerned with various aspects of utilizing Drosophila nephrocytes for modeling mammalian kidney function and disease and contributing valuable insights, in addition to established kidney models, in a quick and cost-effective way. In general, the morphological characterization of a biological sample via electron microscopy strongly depends on the degree of sample preservation. In the first project, the ultrastructural preservation of nephrocytes after preparation for transmission electron microscopy could be greatly improved by using both an optimized dissection saline and cryofixation techniques. Also, the initially challenging immunogold detection of endogenous Crumbs protein could be realized by an indirect approach detecting GFP-tagged Crumbs using an antibody directed against the tag. The 3D ultrastructure of the complex subcellular structures in nephrocytes was further characterized by creating a 3D model of the outlying network of cell membrane invaginations based upon STEM tomography data. In conventional two-dimensional TEM, only a limited assessment of the spatial arrangement of cellular structures in possible. The question whether foot processes of mammalian podocytes interact with other foot processes of the same cell therefore remained unanswered. The second manuscript arrives at the conclusion, that the interaction exclusively happens between foot processes of different podocytes, by thorough investigation of a 3D model, which was based on a whole podocyte, sectioned and imaged using FIB-SEM technology. The cell-cell contacts between foot processes were further characterized via dual-axis tomography in human and mouse podocytes, as well as Drosophila nephrocytes, leading to the realization that there is both one quasiplanar slit diaphragm spanning the whole slit diameter between two processes and additionally several filamentous contacts, which are locally limited. Additional studies are necessary to identify the proteins these two types of cell-cell contacts are composed of. Podocytes are highly complex polarized epithelial cells. For a better understanding of the molecular fundamentals of development and maintenance of normal podocyte function, the role of Pals1, which acts as scaffolding protein and key factor necessary for apicobasal polarization, was more closely investigated in podocytes in the third manuscript. Therein, Pals1 was found to be an essential, specific and dose-dependent regulator of nephrogenesis, being a negative regulator of Hippo and TGF-β signaling in mouse, which was then also confirmed in the Drosophila model. These findings indicate a connection between renal diseases, especially renal cyst diseases, and apical polarity proteins. The pathogenesis of these diseases needs to be better understood by studying the networks regulated by Pals1. In the course of the last project, the role of Drosophila Crumbs (DmCrb) in nephrocytes was closer examined. DmCrb is an interaction partner of Stardust, the Drosophila homolog of Pals1, and a key determinant of apicobasal polarity. It was found to be involved in the regulation of early endocytosis via interaction with Moesin through its FERM-binding domain, located on its C-terminus. It further contributes to nephrocyte diaphragm assembly and maintenance via its extracellular domain. The functions of its different protein domains and the evolutionary conservation within the Crumbs family was examined by conducting a series of rescue experiments with various deletion constructs of DmCrb as well as its human orthologs. The herein describes mechanisms of nephrocyte development and function are likely also conserved in mammalian podocytes.
In den modernen Industrienationen haben sich chronische nichtübertragbare Krankheiten zur Hauptursache menschlicher Sterblichkeit entwickelt. Während der letzten Jahre wuchs die globale Belastung der Gesundheitssysteme durch chronische Nierenleiden beträchtlich und in vielen dieser Fälle sind weder gezielte noch personalisierte Therapien verfügbar. Um mit den steigenden Herausforderungen schritthalten zu können, muss das Verständnis der Ursachen und Mechanismen, die chronischen Nierenkrankheiten zugrunde liegen, vertieft werden und neuartige Herangehensweisen müssen entwickelt und verfeinert werden, damit konventionelle Forschungsansätze gefördert und bereichert werden können. Diese Dissertation umfasst vier Manuskripte, die sich aus unterschiedlichen Blickwinkeln mit dem Potenzial von Drosophila Nephrozyten zur Modellierung von Nierenfunktion und -krankheit in Säugetieren beschäftigen und zeigen, wie diese auf schnelle und kosteneffiziente Weise wertvolle Erkenntnisse zu etablierten Nierenmodellen beitragen können. Die morphologische Charakterisierung einer biologischen Probe mit Hilfe der Elektronenmikroskopie hängt stark vom Grad der Probenerhaltung ab. Im Rahmen des ersten Projektes konnte die ultrastrukturelle Erhaltung von präparierten Nephrozyten sowohl durch die Verwendung einer optimierten Präparationssaline wie auch durch die Umstellung von chemischer auf Kryofixierung während der Vorbereitung zur Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erheblich verbessert werden. Basierend auf Raster-TEM-Tomografie wurde zudem die dreidimensionale Ultrastruktur der komplexen subzellulären Strukturen in Nephrozyten durch die Erzeugung eines 3D-Modells des peripheren Netzwerks der Zellmembraneinstülpungen weiter charakterisiert. Außerdem wurde die epitheliale Polaritätsdeterminante Crumbs beispielhaft auf Epoxid-Ultradünnschnitten über einen indirekten Ansatz mittels GFP-Tag-Detektion nachgewiesen; eine Herangehensweise, die sich problemlos auch auf andere GFP-getaggte Transgene übertragen lässt. Interagieren Fußfortsätze eines Säugetierpodozyten mit anderen Fußfortsätzen desselben Podozyten? Diese Frage blieb bisher unbeantwortet, da in der konventionellen zweidimensionalen Transmissionselektronenmikroskopie nur eine begrenzte Einschätzung der räumlichen Anordnungen von zellulären Strukturen möglich ist. Das zweite Manuskript kommt zu dem Schluss, dass eine Interaktion ausschließlich zwischen Fußfortsätzen unterschiedlicher Podozyten möglich ist. Diese Erkenntnis basiert auf der gründlichen Untersuchung des 3D-Modells eines vollständigen murinen Podozyten, von welchem mittels der FIB-SEM-Technologie schrittweise dünne Schichten abgetragen und aufgenommen wurden. Die Zell-Zell-Kontakte zwischen den Fußfortsätzen wurden mit Hilfe von Zweiachsentomografie in menschlichen und murinen Podozyten, wie auch in Drosophila-Nephrozyten, näher untersucht. Artenübergreifend wurde sowohl entlang des gesamten Schlitzdurchmessers ein quasiplanares Schlitzdiaphragma gefunden, wie auch zahlreiche zusätzliche punktuell-filamentöse Kontakte. Zusätzliche Untersuchungen sind notwendig, um die Proteine zu identifizieren, aus denen diese zwei Arten der Zell-Zell-Kontakte aufgebaut sind. Podozyzen sind hochkomplexe polarisierte Zellen. Für ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen von Entwicklung und Aufrechterhaltung der normalen podozytären Funktion wird im dritten Manuskript die Rolle von Pals1, eines Gerüstproteins und Schlüsselfaktors während der apikobasalen Polarisation in Epithelien, genauer beschrieben. Pals1 kann demnach die Funktion eines essenziellen, spezifischen und dosisabhängigen Regulators zugeschrieben werden, da gezeigt wurde, dass es in Mäusen die Hippo- und TGF-β-Signalwege negativ reguliert, was zusätzlich im Drosophila-Modell bestätigt werden konnte. Diese Erkenntnisse deuten auf eine Verbindung zwischen Nierenkrankheiten, insbesondere in Verbindung mit Zystendefekten, und apikalen Polaritätsproteinen hin. Indem die durch Pals1 regulierten Netzwerke in zukünftigen Studien weiter erforscht werden, kann die Pathogenese dieser Krankheiten besser verstanden werden. Im Laufe des vierten Projektes wurde sodann die Rolle von Drosophila Crumbs (DmCrb) in Nephrozyten näher untersucht. DmCrb ist ein Interaktionspartner von Stardust, dem Drosophila-Homolog von Pals1, und ein maßgeblicher Faktor apikobasaler Polarität. Es wurde nachgewiesen, dass es an der Regulation der frühen Endozytose beteiligt ist, indem es über seine C-terminale FERM-Bindedomäne mit Moesin interagiert. Zudem trägt es über seine extrazelluläre Domäne zur Assemblierung und Aufrechterhaltung des Nephrozytendiaphragmas bei. Die Funktionen seiner verschiedenen Proteindomänen und evolutionäre Konservierung innerhalb der Crumbs-Proteinfamilie wurde untersucht, indem eine Reihe von Rettungsexperimenten mit verschiedenen Deletionskonstrukten von DmCrb, sowie auch seiner humanen Orthologe, durchgeführt wurde. Es ist davon auszugehen, dass die hier beschriebenen Mechanismen von Nephrozytenentwicklung und -funktion in Säugetierpodozyten konserviert sind.
Databáze: OpenAIRE
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