In vitro recruitment and differentiation of human mesenchymal cells for the development of a scaffold-based meniscus repair approach

Autor:	Freymann, Undine
Rok vydání:	2014
Předmět:	cell recruitment polyglycolic acid hyaluronic acid meniscus repair 3-D cultures cell re-differention musculoskeletal system 600 Technik Medizin angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit human serum
DOI:	10.17169/refubium-15347
Popis:	Introduction: Meniscus lesions are a complex orthopedic challenge. Cell-free scaffold-based repair approaches for the non-vascular meniscus zone are rarely developed. Regenerative techniques based on PGA scaffolds with factors that stimulate cell recruitment and differentiation may be an alternative. This work aimed at investigating factors that support the in vitro recruitment and differentiation of human mesenchymal cells for the development of a cell-free scaffold-based meniscus repair approach. Methodology: Isolation and expansion of human meniscus cells as well as evaluation of cell morphology and growth kinetics were performed. Therein, chemokines were identified in synovial fluids from normal, osteoarthritis and rheumatoid arthritis donors by chemokine antibody membrane array. Selected chemokines were tested for their recruiting potential on joint-associated mesenchymal progenitor cells. Human meniscus cells were evaluated for their migratory activity toward increasing doses of human serum. Further studies investigated factors that support re- differentiation of human meniscus cells. Herein, the potential of hyaluronic acid, human serum and TGF-ß3 to induce meniscal extracellular matrix was respectively evaluated on protein and gene expression level in high-density cultures. Subsequent studies assessed cell viability and the induction of typical meniscal genes and proteins after 3-D cell cultivation in hyaluronic acid loaded PGA scaffolds that have been cultured in the presence of hyaluronic acid and human serum. Results: Human meniscus cells were successfully isolated from native meniscus tissue. Cells showed high proliferation and expansion capacities in monolayer cultures and a stable fibroblastoid phenotype. Cell migration assays confirmed that human serum and the chemokines TECK, IP10 and Lymphotactin have the potential to recruit human joint-associated mesenchymal progenitor and meniscus cells. High-density cultures of human meniscus cells showed the induction of meniscal extracellular matrix after stimulation with hyaluronic acid and human serum. Meniscus cells seeded in 3-D scaffold-based cultures showed a high cell viability and the induction of meniscus-like extracellular matrix. Conclusion: Although it is highly speculative and results of these in vitro studies do not reflect in vivo situations, we conclude that a cell-free approach based on PGA scaffolds combined with hyaluronic acid and human serum may have the potential to support in vivo meniscus tissue healing by recruiting resident mesenchymal cells of the knee joint and differentiating them into meniscal cells. Results of this work encourage preclinical studies and the further development of a cell-free approach based on PGA scaffolds in combination with hyaluronic acid and human serum for the repair of human non-vascular meniscus lesions. Einleitung: Verletzungen des Meniskusgewebes stellen ein komplexes orthopädisches Behandlungsproblem dar. Derzeitige Reparaturtechniken sind effektiv für den vaskulären Außenbereich, der Behandlungserfolg lässt sich aber nicht auf den avaskulären Innenbereich übertragen. Eine Alternative zu den wenigen bisher klinisch etablierten zellfreien Trägermatrix-basierten Verfahren könnte hierbei die Entwicklung eines Ansatzes zur Meniskusregeneration auf Basis von resorbierbaren PGA-Trägerstrukturen in Kombination mit Induktionsfaktoren für die Rekrutierung und Differenzierung humaner mesenchymaler Zellen sein. Methodik: Zunächst wurden robuste Methoden zur Isolierung und Vermehrung von humanen Meniskuszellen etabliert sowie deren Wachstumskinetik und Zellmorphologie untersucht. Weiterhin wurden Chemoattraktanten definiert und in einem in vitro Chemotaxis-Testsystem auf ihr Potential zur Rekrutierung von Meniskuszellen und Gelenk-assoziierten mesenchymalen Vorläuferzellen untersucht. Hierzu wurde die zellanlockende Wirkung von Humanserum und ausgewählten Chemokinen untersucht, die zuvor in Synovialflüssigkeiten von gesunden sowie an Osteoarthrose und Gelenkrheumatismus erkrankten Spendern identifiziert wurden. Fortführend wurden Faktoren bestimmt, die eine Re-Differenzierung von humanen Meniskuszellen und die Ausbildung von meniskusartiger extrazellulärer Matrix anregen können. Hierbei wurde der jeweilige Einfluss von Humanserum, Hyaluronsäure und TGF-ß3 auf die Matrixbildung in standardisierten Hochdichte- Pelletkulturen bestimmt und mittels Protein- und Genexpressionsanalysen typischer Meniskusmarker ausgewertet. Des Weiteren wurden humanen Meniskuszellen zusammen mit Hyaluronsäure in resorbierbare PGA-Vliese eingebettet und in Hyaluronsäure- und Humanserum-haltigem Medium kultiviert. Die 3D-Kulturen wurden mittels Zellvitalitätsfärbung und anhand von Protein- sowie Genexpressionsanalysen typischer Meniskusmarker ausgewertet. Ergebnisse: Humane Meniskuszellen konnten erfolgreich aus dem Nativgewebe isoliert und in Monolayerkulturen vermehrt werden. Die Zellen zeigten ein hohes Proliferationsvermögen, ein stabiles Wachstumsverhalten und einen fibroblastoiden Phänotyp. Die Auswertung der Zellmigrationsversuche ergab, dass Humanserum und die Chemokine TECK, IP10 und Lymphotactin das Potential zur Zellanlockung besitzen. Die Stimulation von Hochdichte-Pelletkulturen mit Hyaluronsäure und Humanserum wirkte jeweils begünstigend auf die Ausbildung von meniskusartiger extrazellulärer Matrix. Nach der Kultivierung von humanen Meniskuszellen in 3-D Trägerstruktur-basierten Kulturen konnte eine hohe Zellvitalität und die Induktion einer meniskusartiger extrazellulären Matrix nachgewiesen werden. Schlussfolgerung: In den durchgeführten in vitro Studien konnten Faktoren herausgestellt werden, die eine in vitro Rekrutierung von humanen Meniskuszellen und Gelenk-assoziierten mesenchymalen Vorläuferzellen unterstützen und eine Induktion von meniskusartiger Matrix begünstigen. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ein Trägermatrix-basierter Ansatz aus PGA und in Kombination mit Hyaluronsäure und Humanserum auch die in vivo Reparatur von Meniskusgewebe durch die Rekrutierung von ortsständigen Zellen und deren Differenzierung zu meniskusartigen Zellen unterstützen könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden die Grundlage für präklinische Studien und die weitere Entwicklung eines zellfreien Ansatzes basierend auf PGA-Trägerstrukturen, Hyaluronsäure und Humanserum für die Behandlung von humanen avaskulären Meniskusläsionen.
Databáze:	OpenAIRE
Externí odkaz:	https://explore.openaire.eu/search/publication?articleId=doi_dedup___::c228b7b1ecfda4911b2efc9f89bb3a94 Zobrazit plný text záznamu