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Nematoden-fangende Pilze (NFP) sind eine Gruppe faszinierender, karnivorer Mikroorganismen. Bei N��hrstoffmangel sind sie in der Lage vom saprotrophen Wachstum zu einem r��uberischen Lebensstil zu wechseln. Dieser Wechsel geht mit der Ausbildung hoch-spezialisierter Fallenstrukturen und der Sekretion zahlreicher Signalmolek��le einher. Die Fallen werden ausgebildet, sobald die Pilze Nematoden-spezifische Ascaroside wahrgenommen haben. Nun locken die R��uber ihre Beute in die Fallen, indem sie attraktive, olfaktorische Signale abgeben. Es folgt ein ganzes Arsenal sekretierter Molek��le, um die Kolonisation der Nematoden durch die Pilze sicherzustellen. Dazu sind zun��chst vor allem lytische Enzyme notwendig. Da der Fangvorgang der r��uberischen Pilze relativ schnell abl��uft und keine l��ngerfristige Interaktion bestehen muss, stellt sich die Frage, ob neben den lytischen Enzymen auch kleine sekretierte Proteine eine Rolle spielen. Diese SSPs sind als Virulenzfaktoren und Effektorproteine in vielen tier- und pflanzenpathogenen Pilzen und Bakterien beschrieben. Da die Nematoden im Kontakt mit den Fallen Abwehrmechanismen aktivieren, k��nnten solche Virulenzfaktoren auch f��r die ��berwindung der Strategien der Nematoden f��r NFP wichtig sein. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen dem Nematoden-fangenden Pilz Duddingtonia flagrans und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans untersucht. Bioinformatische Analysen des Genoms haben ergeben, dass das Sekretom des NFPs 249 SSPs beinhaltet. Der Virulenzfaktor-Kandidat CyrA (cysteine rich protein A) ist eines dieser SSPs und wurde charakterisiert, um seine Rolle w��hrend der Attacke aufzukl��ren. Das sekretierte Protein ist au��erdem eines der 170 cysteinreichen Proteinen und wurde bioinformatisch als putativer Effektor vorhergesagt. Die Induktion der Genexpression von cyrA in den Fallen wurde mit Hilfe einer qRT-PCR-Analyse und einem Promotor-Reporterassay gezeigt. Die Lokalisation mit fluoreszenten Proteinen ergab, dass CyrA in dynamischen, vesikelartigen Strukturen in den Fallen lokalisiert und hier an der Innenseite akkumuliert. Nach der Penetration lokalisierte das Protein im Infektionsbulbus, wo es vermutlich sekretiert wird. Besonderheiten des Sekretionswegs in den Fallen wurden durch die Fusion von GFP mit verschiedenen Signalpeptiden deutlich, die fast alle zur Lokalisation in Vesikeln in den Fallen f��hrten, w��hrend im vegetativen Myzel keine Vesikel zu beobachten waren. Durch die Deletion des zu Saccharomyces cerevisiae exo70 orthologen Gens exoA, einer Komponente des Exocyst-Komplexes, wurde au��erdem gezeigt, dass die Akkumulation von CyrA im Infektionsbulbus von diesem Proteinkomplex abh��ngig ist. Das cyrA Gen wurde mittels homologer Rekombination deletiert und Langzeitbeobachtungen des Infektionsprozess zeigten eine verringerte Virulenz der Mutante, die einen l��ngeren Zeitraum f��r die Paralyse der Nematoden ben��tigte. Die heterologe Expression von cyrA in C. elegans f��hrte zu einer verringerten Lebenszeit der Nematoden und gab Hinweise auf eine m��gliche Rolle der C. elegans Coelomocyten w��hrend der Interaktion. Im Laufe dieser Arbeit wurde CyrA als Virulenzfaktor von D. flagrans identifiziert, der f��r die volle Virulenz des Pilzes ben��tigt wird. Es wurde die Hypothese best��tigt, dass SSPs eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen NFP und Nematoden spielen. Au��erdem wurden wichtige Aspekte der Zellbiologie hinter der Sekretion von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze beleuchtet und erste Hinweise auf eine Rolle der Coelomocyten bei der Immunantwort von C. elegans erlangt. Diese Arbeit erlaubt einen ersten Einblick in das bisher noch weitestgehend unerforschte Feld der Analyse von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze. |
