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Vascular Endothelial Growth Factors (VEGFs) are key players in blood and lymphatic vessel development and homeostasis. The family consists of five members, VEGF-A, -B, -C, -D and placenta growth factor (PLGF). They bind to three type V receptor tyrosine kinases (RTKs): VEGF-receptor-1 (VEGFR)-1 (Flt1), VEGFR-2 (KDR/Flk1), and VEGFR-3 (Flt4). VEGFR-2 is the major receptor responsible for angiogenic and vasculogenic signaling by VEGFs involving cell survival, migration and mitogenesis. VEGFRs consist of an extracellular domain (ECD) with seven immunoglobulinhomology domains (Ig-homology domains). The ECD is responsible for ligand binding and contributes to the dimerization process of the receptors by forming homotypic receptor contacts. A single transmembrane helix connects the ECD to the intracellular kinase domain. Ligand binding to VEGFR ectodomains induces dimerization of receptor monomers followed by autophosphorylation of specific tyrosine residues in the intracellular kinase domains. The phosphotyrosine containing activated kinase subsequently recruits signaling proteins thereby activating distinct cellular pathways. Here we show that the introduction of glutamic acid residues into the transmembrane domain (TMD) of VEGFR-2 leads to dimerization and induces conformational changes in the TMD. A subsequent rearrangement of the intracellular kinase domains gives rise to either active or inactive receptor dimers. We also show that the ECD of VEGFR-2 plays an essential autoinhibitory role in the absence of ligand. Furthermore, high-resolution structural analysis of isolated wild type (wt) and mutant TMD by NMR spectroscopy reveal TMD conformations presumably essential for receptor activation. In a second project, we analysed the function of the kinase insert domain (KID) and the C-terminal domain (CD) in VEGFR-2 activation. We show that these domains regulate VEGFR-2 activity. The KID, and particularly a canonical tyrosine residue located at position 951 are highly relevant for kinase activation. Deletion of the CD renders VEGFR-2 constitutively active and we thus think that the CD of VEGFR-2 maintains the receptor in the inactive state in the absence of ligand. Low resolution structural data derived from small angle X-ray scattering (SAXS) and MALS (Multi Angle Light Scattering) give evidence that the kinase domain of VEGFR-2 undergoes significant conformational changes when switching from the inactive to the active state. The activated kinase domain adopts an elongated, open conformation whereas the inactivated kinase domain remains in a globular compact conformation with the CD presumably blocking the catalytic site of the kinase similar to the autoinhibited conformation previously demonstrated for the Tie-2 kinase domain. Additional sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation (AUC) experiments of kinase domain mutants demonstrated that the KID and the CD are necessary to sustain an intrinsic dimerization propensity that potentially supports the dimerization process induced by ligand binding to the ECD. Deletion mutants showed lower affinity forming dimers only at higher concentration. In experiments aiming to investigate phosphorylation kinetics of the VEGFR-2 kinase domain we finally showed that VEGFR-2 follows a well-ordered sequence of residue-by-residue phosphorylation. In a third project we were interested in characterizing the in vitro interaction between TSAd and activated VEGFR-2. Y951 mediated complex formation of TSAd with VEGFR-2 was found to be critical for VEGF-induced actin reorganization and migration but did not affect mitogenicity in endothelial and tumour cells. We were interested to gain insights on the binding mode by means of high and low-resolution structural biology methods. Initial size exclusion chromatography (SEC) and MALS analysis verified TSAd-VEGFR-2 interaction in vitro. SAXS analysis of the isolated binding partners and the complex revealed that pY951 mediated binding of TSAd resulted in an elongated multiprotein complex in which the binding partners orient in a presumably parallel orientation. ---------- Zusammenfassung: Die Familie der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGFs) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung des Blut- und Lymphgefässsystems. Die Familie besteht aus VEGF-A, -B, -C, -D und PLGF. Die Wachstumshormone binden an drei Typ V Rezeptor-Tyrosin-Kinasen: VEGFR-1 (Flt1), VEGFR-2 (Flk1) und VEGFR-3 (Flt4). VEGFR-2 ist mehrheitlich für die VEGF induzierte Aktivierung von angiogenen und vaskulogenen Signalwegen und den daraus resultierenden biologischen Effekten verantwortlich. Die VEGF-Rezeptoren besitzen eine extrazelluläre Domäne bestehend aus sieben immunoglobulinähnlichen Proteindomänen, die nebst der Rekrutierung von Liganden auch der Dimerisierung des Rezeptors durch Ausbildung von homotypischen Kontakten dient. Eine einzelne Transmembranhelix verbindet die extrazelluläre Domäne mit der intrazellulär geteilten Kinasedomäne. Die Ligandenbindung an den Rezeptor führt zu Dimerisierung und der darauf folgenden Aktivierung durch Autophosphorylierung an spezifischen Tyrosinen in der Kinasedomäne. Die Phosphotyrosine rekrutieren daraufhin Signalmoleküle, die in der Lage sind spezifische Signalwege zu aktivieren. Wir konnten zeigen, dass Glutaminsäure-Mutationen in der Transmembrandomäne von VEGFR-2 zu Konformationsänderungen in der Helix führen. Die daraus folgende Neuausrichtung der Kinasedomänen resultierte in aktiven und inaktiven Rezeptorkonformationen. Es gelang uns auch aufzuzeigen, dass die extrazelluläre Domäne von VEGFR-2 eine wichtige Rolle bei der Blockierung des Rezeptors im inaktiven Zustand in Abwesenheit des Liganden spielt. Hochaufgelöste Strukturanalysen von isolierten Wildtyp und mutierten Transmembrandomänen ergaben Strukturen, die höchstwahrscheinlich bei der Aktivierung des Rezeptors eine essentielle Rolle spielen. Ein zweites Projekt hatte zum Ziel, die Rolle der Kinase-Insertions-Domäne (KID) und der C-terminalen Domäne (CD) bei der VEGFR-2 Aktivierung zu entschlüsseln. Wir konnten zeigen, dass die KID und die CD die VEGFR-2 Aktivierung regulieren. Die KID und ein spezifisches Tyrosin in Position 951 innerhalb der KID waren essentiell für die Kinaseaktivierung. Deletion der CD führte zu konstitutiver Aktivierung von VEGFR-2. Wir denken, dass die CD den Rezeptor in Abwesenheit des Liganden im inaktiven Zustand behält. Mittels Small Angle X-ray Scattering (SAXS) und Multi Angle Light Scattering (MALS) erhaltene Strukturdaten beweisen, dass die Aktivierung der Kinasedomäne von VEGFR-2 mit einer signifikanten Änderungen in der Konformation einhergeht. Die aktive Kinasedomäne nimmt eine längliche, offene Konformation ein, wohingegen die Inaktive in einer globulären, geschlossenen Konformation verbleibt. Sehr wahrscheinlich blockiert die CD dabei das katalytische Zentrum des Enzyms, vergleichbar mit dem Mechanismus der von der Tie-2 Kinasedomäne verwendet wird. Sedimentation Equillibrium Analytical Ultracentrifugation (AUC) Experimente haben gezeigt, dass die KID und die CD wichtig sind, um die intrinsische Dimerisierungskapazität der Kinasedomäne zu erhalten. Diese intrinsische Tendenz unterstützt vermutlich die ligandeninduzierte Dimerisierung bei der Rezeptoraktivierung. Deletionsmutanten zeigen eine niedrigere Tendenz zur Dimerisierung mit steigender Proteinkonzentration. Experimente, die zum Ziel hatten die Phosphorylierungskinetik der Kinasedomäne zu untersuchen, ergaben eine zeitlich geordnete sequentielle Aktivierungssequenz. In einem dritten Projekt untersuchten wir die in vitro Interaktion von T-Zell spezifischem Adapterprotein (TSAd) mit der aktiven Kinasedomäne von VEGFR-2. Es wurde gezeigt, dass die Y951 vermittelte Komplexbildung von TSAd mit VEGFR-2 zu VEGF induzierter Aktinreorganisation in den Zellen führt. Die Endothel- und Tumorzellen wurden dadurch zur Migration gebracht, wobei die Mitogenität unverändert blieb. Unser Ziel war es, mittels hoch- und niedrigauflösenden strukturbiologischen Methoden spezifische Informationen zur Interaktion von TSAd und VEGFR-2 abzuleiten. Erste chromatographische Analysen und Experimente mittels Multi Angle Light Scattering (MALS) bewiesen die Interaktion der beiden Proteine in vitro. SAXS Analysen der isolierten Bindungspartner und des Komplexes ergaben einen länglichen Signalkomplex, in dem sich die Bindungspartner parallel ausrichten. |
