A Simplified Method for Obtaining cDNA of Low-Copy and Silent Eukaryotic Genes Using Human Renalase as an the Example
| Autor: | V.I. Fedchenko, A.A. Kaloshin |
|---|---|
| Rok vydání: | 2019 |
| Předmět: |
0301 basic medicine
Expression vector Nucleic acid sequence General Medicine Computational biology Biology Amplicon 03 medical and health sciences genomic DNA Restriction site Exon expression cloning exon PCR cDNA EXPERIMENTAL RESEARCH 030104 developmental biology 0302 clinical medicine 030220 oncology & carcinogenesis Complementary DNA экспрессия клонирование экзон ПЦР кДНК Gene |
| Zdroj: | Biomedical Chemistry: Research and Methods; Vol. 2 No. 2 (2019); e00101 Biomedical Chemistry: Research and Methods; Том 2 № 2 (2019); e00101 Biomedical Chemistry: Research and Methods |
| ISSN: | 2618-7531 |
| DOI: | 10.18097/bmcrm00101 |
| Popis: | A simplified «exon» method was developed for producing cDNA of low-copy and silent eukaryotic genes. It is based on assembly of the target gene from genomic DNA by direct synthesis of its exons, followed by their PCR-based joining without further purification of the amplicons. During the synthesis of exons, direct primers were used; these included about ~ 20 nucleotides of the 3`-terminal sequence previous (from the amplified) exon and ~ 20 nucleotides of the 5`-initial sequence of the amplified exon. Reverse primers included ~ 20 nucleotides complementary to the terminal sequence of the amplified exon. Forward and reverse primers flanking the gene to be assembled included the restriction sites necessary for insertion into the expression vector. Using this approach it is possible to assemble almost any eukaryotic gene with a known nucleotide sequence of genomic DNA available in the database. Разработан упрощенный «экзоновый» метод получения кДНК низкокопийных и молчащих эукариотических генов. Он основан на сборе целевого гена с геномной ДНК путем прямого синтеза его экзонов с последующим их объединением ПЦР без дополнительной очистки ампликонов. При синтезе экзонов использовали прямые праймеры, которые включают примерно ~20 нуклеотидов 3’-концевой последовательность предыдущего от амплифицируемого экзона и ~20 нуклеотидов 5’-начальной последовательности амплифицируемого экзона. Обратные праймеры включали ~20 нуклеотидов комплементарной концевой последовательности амплифицируемого экзона. Прямой и обратный праймеры, фланкирующие собираемый ген, включали сайты рестрикции, необходимые для встраивания в экспрессирующий вектор. Такой подход позволяет быстро собрать практически любой эукариотический ген по известной нуклеотидной последовательности геномной ДНК, имеющейся в базе данных. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
|