Die Rolle von Lmx1b bei der Aufrechterhaltung der podozytären Struktur

Autor: Kastner, Jürgen
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2013
Předmět:
Popis: Eine Beteiligung von LMX1B an Entwicklungsvorgängen ist unumstritten, gibt es doch zahlreiche fehlentwickelte Strukturen, die auf einen LMX1B-Defekt zurückzuführen sind. Wie diese Vorgänge allerdings ablaufen, ist noch weitgehend unerforscht. Ein geeignetes Mittel hierfür war die Entwicklung der konventionellen Lmx1b-Knockout Maus, anhand derer man zahlreiche strukturelle und molekulare Veränderungen bei einem Lmx1b-Defekt untersuchen konnte. Übereinstimmend bei Patienten und Knockout Mäusen konnten so Veränderungen der Augen, Gliedmaßen und der Nierenstruktur nachgewiesen werden. Durch die Entwicklung der Podozyten-spezifischen Lmx1b-Knockout Maus war eine nähere Untersuchung der Nierenveränderungen möglich, wodurch allerdings auch eine primäre Entwicklung der Podozyten festgestellt werden konnte, während die Podozyten sekundär wieder verloren gingen. Das warf die Frage auf, ob Lmx1b auch für die Aufrechterhaltung der podozytären Struktur verantwortlich ist. Hierfür wurde eine induzierbare Podozyten-spezifische Lmx1b-Knockout Maus entwickelt, bei der Lmx1b zum gewünschten Zeitpunkt speziell in den Podozyten ausgeschaltet werden konnte. Diese induzierbare Podozyten-spezifische Lmx1b-Knockout Maus entwickelte bereits nach einwöchiger Induktion mit Doxyzyklin eine heftige Proteinurie, welche über einen längeren Zeitraum nur noch leicht zunahm. Untersuchte man allerdings diese einwöchig induzierten Mäuse, konnte man keine gravierenden Schädigungen der Nierenstruktur feststellen. Immunhistologische Analysen für Strukturproteine der GBM bzw. Podozyten wiesen eine normale Färbung auf, und sogar in elektronenmikroskopischen Aufnahmen dieser Nieren konnten nur geringe Veränderungen wie gelegentliche Verluste von Podozyten festgestellt werden. Da zu diesem Zeitpunkt die Proteinurie allerdings schon relativ hoch war, mussten andere Gründe ursächlich für den Verlust der Fitrationsbarriere sein, konnte doch nachgewiesen werden, dass Podozyten Apoptose begehen und somit verloren gehen. Zusätzlich zu diesen Beobachtungen zeigten Versuche mit HeLa-Zellen (Scratch-Assay bzw. Beweglichkeitsstudien), dass diese eine erhöhte Motilität aufwiesen, wenn kein LMX1B produziert wurde. Übereinstimmend hierzu war ein vermehrtes Auswachsen von Podozyten aus präparierten Glomeruli von induzierten Podozyten-spezifischen Lmx1b-Knockout Mäusen festzustellen. So lässt sich zusammenfassen: Ist Lmx1b/LMX1B vorhanden, sind die Zellen unbeweglicher, fehlt Lmx1b/LMX1B, können sie sich freier bewegen. Eine erhöhte Motilität von Zellen kann zwei Ursachen haben: Zum einen kann das Zytoskelett betroffen sein, indem es eine veränderte Organisation aufweist und somit die Zellen bei Wanderungen beweglicher sind, oder zum anderen kann die Kontaktvermittlung beeinträchtigt sein, wodurch Zellen nicht so stark an ihrer Oberfläche haften und somit wiederum eine erhöhte Motilität zeigen. Der Vergleich des Aufbaus des Zytoskeletts von HeLa-Zellen mit und ohne LMX1B zeigte keine Unterschiede in der Organisation. Auch Analysen von Strukturproteinen oder des Membranpotentials wiesen keine Beeinträchtigungen auf. Bei der Untersuchung der Kontaktvermittlung von Podozyten wurden insbesonders die Integrine untersucht, da Podozyten mit der darunterliegenden GBM über die Integrine α3 und β1 verankert sind. In der Tat konnte ein geringerer Spiegel an α3-Integrin in HeLa-Zellen ohne LMX1B im Western Blot nachgewiesen werden und auch eine Beeinträchtigung der Anheftung der Zellen durch Verwendung von zyklischem RGD, einem kompetitiven Liganden für Integrine, zeigte in HeLa-Zellen ohne LMX1B eine stärkere Auswirkung. Weitere Kontakt-vermittelnde Proteine, wie FAK oder ILK, scheinen hingegen nicht betroffen zu sein. Aus vorliegenden Ergebnissen ist daher zu schließen, dass Lmx1b/LMX1B die Kontaktvermittlung über Integrine moduliert und bei einem Ausfall in Mäusen ein Verlust der Adhäsion von Podozyten zur GBM folgt, woraufhin die Podozyten verloren gehen und die Bildung einer Proteinurie verursacht wird. Zusätzlich zu diesem Hauptthema dieser Doktorarbeit wurden auch immunologische Tests an Mäusen durchgeführt, da Vorversuche eine mögliche Beeinträchtigung der Immunantwort in Lmx1b(+/-)-Knockout Mäusen ergaben. Während eine Herabregulierung von Interferonen in Milz und Thymus und eine schwächere Aktivierung von basophilen Granulozyten in der Milz festgestellt werden konnte, zeigte eine Genexpressionsanalyse dieser Organe, dass hier kein Lmx1b exprimiert wird. Auch eine Analyse von Makrophagen oder dendritischen Zellen deckte keine Lmx1b-Expression dieser einwandernden Zellen auf. Allerdings zeigte ein Schädigungsmodell durch Injektion eines anti-GBM-Serums eine unterschiedliche Reaktion von Lmx1b(+/+)- und Lmx1b(+/-)-Mäusen. Während alle Wildtyp Mäuse gesund blieben, bildeten einige heterozygote Mäuse eine heftige Proteinurie. Aufgrund des sehr heterogenen Erscheinungsbildes müssen diese Versuche allerdings mit höherer Fallzahl wiederholt werden. Dies wäre ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Immunregulation durch Lmx1b.
An involvement of LMX1B in developmental processes is undisputed because of numerous misdeveloped structures, which can be attributed to a defect of LMX1B. How these processes occur, however, is still largely unexplored. A suitable system to investigate the role of LMX1B was the creation of a conventional Lmx1b-knockout mouse, where you were able to examine a number of structural and molecular changes. Consistent with patients and knockout mice changes of the eye, limb and kidney structure were demonstrated. Through the creation of a podocyte-specific Lmx1b-knockout mouse, a closer examination of the renal lesions was possible, which also shows a primary development of podocyte foot processes but mature podocytes were lost secondarily. That raised the question, whether Lmx1b is also responsible for maintaining the structure of fully differentiated podocytes. For this purpose, an inducible podocyte-specific Lmx1b-knockout mouse was created, in which Lmx1b could be knocked down at the desired time point. This inducible podocyte-specific Lmx1b-knockout mouse developed severe proteinuria already after one week into induction. Surprisingly, no serious defect of kidney structure was detected at this time point and immunohistological analysis of structure-specific proteins exhibited a normal staining. Also apoptosis was detected for podocytes in the kidney. In addition to these observations, experiments with HeLa-cells have shown an increased motility of the cells when no LMX1B was produced. Consistent to this, an increased outgrowth of podocytes from glomeruli prepared from induced podocyte-specific Lmx1b-knockout mice was observed. Thus, for summarized, missing Lmx1b/LMX1B results in a higher motility of the cells. You can propose two reasons for the increased motility of cells: Firstly, organization of the cytoskeleton is affected so cells are more mobile or, on the other hand, the contact to the surface is affected and thus in turn shows an increased motility. The comparison of the cytoskeleton-structure of HeLa cells with or without LMX1B showed no difference in the organization of it. But by investigation of the attachment of the cells to the surface, HeLa cells showed less α3-integrin without LMX1B and also an impairment of adhesion of the cells by use of cyclic RGD, a competitive ligand for integrins. From present results we conclude that Lmx1b/LMX1B modulates the contact of the cells to their surface via integrins, and in case of failure in mice, a loss of adhesion of podocytes to the GBM followed. In addition to this main topic of this thesis immunological assays were performed, because preliminary tests showed a possible impairment of the immune response in Lmx1b(+/-)-knockout mice. While a down-regulation of interferons in the spleen and thymus and a weaker activation of basophilic granulocytes in the spleen could be observed, a gene expression analysis of these organs showed no expression of Lmx1b. Also, an analysis of macrophages or dendritic cells revealed no Lmx1b expression of these infiltrating cells. However, injection of an anti-GBM serum revealed a different reaction in Lmx1b(+/+)- and Lmx1b(+/-)-mice. While all wildtype mice remained healthy, some heterozygous mice showed severe proteinuria.
Databáze: OpenAIRE
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