Estabelecimento e cultura in vitro de raizes normais e transformadas com Agrobacterium rhizogenes para estudos de terpenos de interesse em genotipo superior de Artemisia annua L
| Autor: | Marques, Daniela de Argollo |
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| Přispěvatelé: | Shepherd, Simone Liliane Kirszenzaft, 1947, Sodek, Ladaslav, Carrer, Helaine, Foglio, Mary Ann, Siqueira, Walter, Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS |
| Rok vydání: | 2021 |
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| Zdroj: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) instacron:UNICAMP |
| DOI: | 10.47749/t/unicamp.2002.246077 |
| Popis: | Orientador : Simone Liliane Kirszenzaft Shepherd Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas do gênero Artemisia se constituem numa rica fonte de sesquiterpenos, os quais têm recebido grande atenção dos pesquisadores devido a sua diversidade química e biológica. A contínua investigação da presença de compostos secundários de interesse bem como de protocolos eficientes para a viabilização e otimização da produção em larga escala dos mesmos são extremamente recomendados e necessários para a exploração desta rica fonte de novos agentes quimioterapêuticos e agriculturaís. A planta alvo deste estudo foi o florido CPQBA 2/39 x PL5 da espécie Artemisía annua, o qual foi obtido pelo programa de melhoramento genético da MEDIPLANT e do CPQBA. Com a finalidade de se manter algumas características desejáveis deste genótipo superior, tais como alta produção de biomassa e de artemisinina, um sesquiterpeno com ação antimalárica, o presente trabalho teve início a partir de um único explante meristemático, o qual foi excisado de uma única planta matriz do híbrido melhorado cultivada nos campos experimentais do CPQBA. Após o desenvolvimento do explante meristemático selecionado, este foi micropropagado até a obtenção de um banco de material homogêneo in vitro com número adequado de plantas sadias, as quais serviram como fontes de explantes para os experimentos posteriores. Foram desenvolvidas metodologias para a iniciação, estabelecimento e cultivo de raízes tanto normais como transformadas com duas cepas de Agrobacterium rhizogenes (15834 e 8196). A confirmação do caráter transgênico das raízes foi obtida por "Dot Blot", um método rápido e eficiente de triagem que permitiu uma análise molecular qualitativa. Estudos relacionados com a formação de calos e a morfogênese in vitro das raízes transformadas obtidas com ambas as cepas também foram realizados. Os extratos dos materiais vegetais foram analisados por cromatografia gasosa acoplado a um espectrômetro de massas (CGIEM) de acordo com metodologia analítica e de alta sensibilidade para detecção de terpenos que foi desenvolvida por pesquisadores do CPQBAlUNICAMP. Os extratos dos calos obtidos bem como das raízes transformadas e normais estabelecidas e cultivadas em diferentes meios de cultura e sobre diferentes condições fotoperiódicas foram analisados quimicamente para a avaliação de alguns terpenos de interesse, tais como: artemisinina e ácido artemisinínico, além de dois outros compostos com forte atividade antiulcerogênica: dihídro-epideoxí-artenuína B edeoxiartemisinína. Os resultados destas análises revelaram que nenhum dos terpenos mencionados estavam presentes nos extratos dos calos e das raízes transformadas analisadas. Os cromatogramas dos extratos das raízes normais cultivadas em meio MS líquido desprovido de fitorreguladores revelaram a presença do composto antiulcerogêníco dihídro-epideoxi artenuína B e de um outro composto ainda não identificado. Pelas características do padrão de ttacionamento do espectro obtido por CG/EM, podemos sugerir que este composto não identificado é também um terpeno, no entanto a confirmação desta hipótese deverá ser objetivo de trabalhos futuros. As condições fotoperiódícas de cultivo influenciaram na produção destes dois terpenos, sendo que a produção do composto não identificado foi inversamente proporcional à produÇão de dihídro-epideoxí-artenuína B, ou seja, sob condição de escuro contínuo, quando díhidro-epideoxi-artenuína B foi intensamente produzido, o composto não identificado foi detectado em pequenas proporções, e, sob fotoperíodo de 16 horas, o inverso ocorreu. A quantificação de dihídro-epideoxi-artenuína B por Cromatografia gasosa acoplado a um Detector de Ionização de Chamas (CG/DIC) revelou um aumento de aproximadamente cinco vezes na produção deste composto pelas raízes normais cultivadas sob condição de escuro contínuo em relação às raÍzes cultivadas na presença de 16 horas de luz. A presença de auxína no meio MS mantido sob condições de 16 horas de luz resultou em alta produção do composto não identificado pelas raizes normais, enquanto que a produção de dihidro-epideoxi-artenuína B não foi detectada nestas raízes através das metodologias empregadas. Os terpenos de interesse também foram estudados quanto as suas atividades antimicrobianas através de ensaios bioautográficos. Para os testes biológicos foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis, Salmonella hoterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escherichía colí, Staphylococcus aureus, Candida albícans, Pseudomonas aeruginosa. Os resultados destes testes mostraram que nenhum dos terpenos de interesse apresentou atividade antifúngica com a linhagem de Ccmdida a/bicans. A atividade antibacteriana foi comprovada para artemisinina e para o ácido artemisinínico, com as linhagens das bactérias B. subitílís, R equí, S. aureus e E. coZi. O composto dihidro-epideoxi artenuína B apresentou atividade antibacteriana com as linhagens das bactérias B. subtil is, M luteus e S. aureus e o composto deoxiartemisinina com as linhagens B. subtilis, R equi, M luteus e S. aureus Abstract: Plants of the Artemisia genera are a rich source of sesquíterpenes, whích have received great attentíon flOm researchers due to theírits bíologícal and chemícal diversíty. The continued investigation of the presence of secondary compounds is hígh1y recommended and necessary for the exploration of this rich source of new chemotherapeutic and agricultural agents. The plant targeted ín this study was the CPQBA 2/39 x PL5 hybrid of the A. annua specíes, obtaíned through the genetíc ímprovement plOgram of Jv1EDIPLANT and CPQBA. With the intent ofkeeping some ofthe desirable characteristícs ofthis superior genotype, such as high production of biomass and artemisinin, a sesquiterpene with antímalarial plOperties, the present study began with a síngle meristematíc explant, excísed from a síngle ímplOved hybrid matrix plant cultívated ín CPQBA's experimental fields. Afier the development of the selected meristematic explant, it was micropropagated until an in vitro homogenous material bank was obtained with a adequa te number of healthy plants, which served as explant sources for later experiments. Methodologies were developed for the estabIíshment and cultivation of roots, both normal and transformed wíth two straíns of Agrobacterium rhizogenes (15834 and 8196). The confirmation of the transgenic nature of the roots was obtained by the "Dot Blot" technique, a fast and efficient screening method that allows a qualitative molecular analysis. Studíes related to the formatíon of callus and the in vitro morphogenesís of the transformed lOots obtaíned wíth both straíns were also undertaken. The plant material extracts were I analyzed by Gasos Chrmatography acopladed to Spectrum Mass (GCIMS) according to the analytical methodology incorporating high sensitivity terpene detection developed by CPQBAlUNICAMP researchers. The callus extracts as weIl as the transformed and normal roots establíshed and cultívated ín different culture media under different photoperiodic condítions were chemicaIly analysed for evaluation of relevant terpenes, such as: artemisinin, artemisiníc acid, as well as two other compounds wíth strong antíulcerogenic actívity: dihydro-epideoxi-artenuin B and deoxiartemisinin. The analysis of results revealed that none of the afore mentíoned terpenes were present in the callus extracts or transformed roots. The chromatograms of the extracts taken úom normal roots cultivated in MS liquid medium deprived of phytoregulators revealed the presence of the antiulcerogenic compound dihydro epideoxi-artenuin B and another as yet unidentified compound. The characteristics of the mass fractíoning pattem observed on GC/MS suggest that this unidentífied compound is also a terpene, however confirmation of this hypothesis requises further studies. Photoperiod during cultívatíon ínfluenced the productíon of both these terpenes, wíth the productíon of the unidentified compound beíng inversely proporcional to the production of dihidro-epideoxi artenuin B. Under continuous darkness dihidro-epideoxi-artenuin B was intensely produced and the unidentified compound present in small proportions, whereas the inverse ocurred in a 16 hour photoperiod The quantificatíon of dihydro-epídeoxi-artenuin B by Gasos Chromatography acopladed to Flame Ionization Detector (CG/FID) revealed as approximately fivefold increase in the production of this compound by normal roots cultívated under continuous darkness compared to roots cultivated in the presence of 16 hour of light. The presence of auxin in the MS medium maintained under 16 hour of light resulted in substantial production of the unidentífied compound by normal roots, while the production of dihidro epideoxi-artenuin B was not detected in these roots by the methods employed. The relevant terpenes were also studied with regard to their antimicrobial properties through bíoautographic tests. For such tests the foIIowíng microorganisms were used: o....I Baci/lus subtilis, Salmonella choterasuis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi, Escheríchía colí, Staphylococcus aureus, Candída albícans, Pseudomonas aerugínosa. The results of these tests showed that none of the relevant terpenes presented antifungaI activíty wíth the Candida albicans líne. The antíbacterial activíty was confirmed for rtemisinin and artemisinic acid, using B. subti/is, R equi, S. aureus, and E. co/i Unes. The compound dihydro-epídeoxi-artenuin B showed antíbacterial actívity with the bacterial lines B. subítílis, M [uteus, and S. aureus and the compound deoxiertemisinin with the Unes B. subitilis, R. equi, M [uteus, and S. aureus Doutorado Doutor em Biologia Vegetal |
| Databáze: | OpenAIRE |
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