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In this study, a fraction of the venom that possesses coagulant activity was characterized and purified. It corresponds to a new protein snaclecs-like (C-type lectin) uracolectin, obtained by three purification steps (anion exchange chromatography, molecular exclusion, and affinity) and HPLC C-18 reverse phase chromatography as final criterion of purity. Prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT) of human plasma were shortened by the addition of uracolectin. Uracolectin exhibited reduction of the coagulant activity on plasma; however, no coagulant effect was observed on fibrinogen, which correlated with the snaclecs mechanism of action on the coagulation cascade. It was heat stable up to about 37°C, loosing total activity at 60°C; it was constant at pH 7 and not inhibited by EDTA and/or benzamidine. Uracolectin had no activity in the platelet inhibition assays with ADP. Finally, the purified protein was sequenced giving as N-terminal DLPSGWSSYEGH and DGPSGWSSYEGH matching with C-type lectins with coagulant activity isolated from Crotalus oreganus helleri, C. adamanteus rattlesnakes and Habu Protrobothrops flavoviridis. This study evidenced the presence of a novel C-type lectin-likeprotein named uracolectin. RESUMEN En este estudio una fracción de veneno con actividad coagulante fue purificada y caracterizada, correspondiendo a una nueva proteína snaclecs (Lectina Tipo C) nombrada uracolectina. Fue obtenida por tres pasos de purificación (cromatografía de intercambio aniónico, exclusión molecular y afinidad) y cromatografía HPLC de fase reversa, como criterio final de pureza. Ambos, el Tiempo de Protrombina (PT) y el Tiempo Parcial de Tromboplastina (aPTT) fueron reducidos por la adición de la uracolectina. Esta demostró producir la reducción de la actividad coagulante en plasma; sin embargo, ningún efecto fue observado sobre el fibrinógeno, lo cual se correlaciona con el mecanismo de acción de las snaclecs sobre la cascada de coagulación. Uracolectina fue estable a los 37°C y a un pH 7 y no inhibida por EDTA y/o benzamidina, perdiendo totalmente su actividad a los 60°C. Uracolectina no tuvo actividad en el ensayo de agregación plaquetaria con ADP. Finalmente, la proteína purificada fue secuenciada dando como N-terminal DLPSGWSSYEGH y DGPSGWSSYEGH relacionándose con Lectinas Tipo C con actividad coagulante, aisladas de Crotalus oreganus helleri, C. adamanteus rattlesnakes y Habu Protrobothrops flavoviridis. Este estudio demostró la presencia de una nueva Lectina Tipo C-similar (snaclecs) nombrada uracolectina. |
