Die Rolle zweier Zn(II)2Cys6 binukleärer Clusterproteine in der sexuellen Entwicklung von Aspergillus nidulans
| Autor: | Vienken, Kay |
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| Přispěvatelé: | Fischer, Reinhard (Prof. Dr.) |
| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2005 |
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| Popis: | Der filamentöse Ascomyzet Aspergillus nidulans ist ein ubiquitär vorkommender Bodenorganismus. Sein homothallischer Lebenszyklus ermöglicht ihm die Bildung von asexuellen und sexuellen Sporen auch ohne Kreuzungspartner. Die asexuelle Entwicklung vollzieht sich in einem kurzen Zeitraum und die asexuellen Sporen, Konidien genannt, können durch Wind und Wasser verbreitet werden. Die Bildung der sexuellen Sporen ist komplizierter und zeitaufwendiger. Die sexuellen Sporen können nach ihrer Reifung viele Jahre im Boden verweilen, bis sie unter günstigen Bedingungen wieder auskeimen. Die Differenzierung einfacher Hyphen zu komplexen Fruchtkörpern, in denen die Prozesse der Karyogamie und Meiose stattfinden, ist sehr energieaufwendig und bedarf großer Umstellungen in den Zellen. Deshalb ist die Fruchtkörperbildung strikt reguliert. Viele äußere Faktoren, wie z.B. das Nährstoffangebot oder Licht entscheiden über die Einleitung der sexuellen Entwicklung. Die Regulierungen und die morphogenetischen Veränderungen des Pilzes während dieses Prozesses sind bisher weitestgehend nicht untersucht. In dieser Arbeit wurden zwei putative Transkriptionsfaktoren, rosA ( repressor of sexual development ) und nosA ( no sex ), identifiziert und charakterisiert, die einen wichtigen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung in A. nidulans haben. Beide gehören zu der Familie der Zn(II)2Cys6 binukleären Clusterproteine. Im Fall von nosA hat sich gezeigt, dass dieser Regulator für die funktionsfähige sexuelle Reproduktion essentiell ist. Die Einleitung der sexuellen Entwicklung ist nicht betroffen, doch bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt stoppt dieser Prozess. Der Effekt der geblockten sexuellen Entwicklung ist nicht 100%ig, da noch in sehr geringen Mengen Fruchtkörper gebildet werden. Diese weisen allerdings nur noch ein Bruchteil der Größe von Kleistothezien eines Wildtyps auf. Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription zweier Gene der sexuellen Entwicklung, cpeA und hxtA, von nosA abhängig ist. Da die Überexpression eines bereits beschriebenen Regulators, nsdD, den Effekt der Deletion von nosA nicht ausgleichen konnte, wurde geschlossen, dass NosA in der Regulationskaskade NsdD nachgeschaltet ist oder in parallelen Wegen fungiert. Im Fall des zweiten Transkriptionsfaktors rosA wurde gezeigt, dass dieser Regulator als ein Repressor der sexuellen Entwicklung fungiert. Er verhindert die Einleitung der sexuellen Entwicklung in Flüssigkulturen, sowie auf Medien mit niedrigen Glukose-Konzentrationen. In Flüssigkultur wirkt RosA als ein Repressor der bereits bekannten Regulatoren veA, nsdD, stuA und auch nosA. RosA kann im Kern lokalisieren, jedoch wird der Kerneintritt offensichtlich durch eine Region im Mittelteil des Proteins erschwert, bzw. verhindert. Diese Region konnte auf ca. 150 Aminosäuren eingeengt werden. Diese Befunde weisen auf eine postranskriptionelle Regulation des Proteins hin. Neben der Charakterisierung von rosA und nosA erfolgte ein ungerichteter Ansatz zur Identifizierung von Proteinen, die während der Fruchtkörperbildung differenziell exprimiert werden. Dies geschah mit einem Vergleich von Proteinmustern zu zwei verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung, jeweils im Wildtyp und zwei Entwicklungsmutanten. Eine der untersuchten Mutanten, die ?nsdD-Mutante, bildet nur asexuelle Sporen und es findet keine sexuelle Entwicklung statt. Die zweite Mutante war die in dieser Arbeit charakterisierte ?nosA-Mutante, in der die sexuelle Differenzierung zu einem frühen Zeitpunkt stoppt. So war ein Vergleich zwischen früher und später sexueller und asexueller Entwicklung möglich. Zusätzlich konnten potentielle Zielproteine des Regulators NosA gefunden werden. Die Auftrennung der Proteine erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. Es wurden starke Unterschiede in den Proteinmustern der verschiedenen Entwicklungsstadien gefunden. Einige der differenziell exprimierten Proteine konnten mittels Massenspektroskopie identifiziert werden. Darunter befanden sich unbeschrieben Proteine mit einer möglichen Funktion in der Fruchtkörperbildung (z.B. zwei 14-3-3 Proteine). Außerdem fanden sich Proteine, deren Funktion in der sexuellen Entwicklung bereits bekannt ist (CpeA); sowie bereits beschriebene Proteine, deren mögliche Rolle in der sexuellen Entwicklung neu ist (CatB). The homothallic ascomycete Aspergillus nidulans reproduces asexually through conidiospores and sexually through ascospores, formed in cleistothecia. Development of cleistothecia is strongly regulated and happens only, if several biotic and abiotic factors play together. For example, sexual development needs an air interface and darkness to be started, whereas asexual structures are formed in the light. The molecular regulation of sexual development is largely unknown, especially after the onset of the developmental program. The availability of the genomic DNA sequence of A. nidulans allowed us to apply a reverse genetic approach and ask whether regulators discovered in other organisms exist in A. nidulans and what there function would be. Recently, a Zn(II)2Cys6 transcription factor (Pro1) was described in the homothallic fungus Sordaria macrospora (Masloff et al., 1999). Mutation of this regulator resulted in a specific block of perithecium development and thus no mature fruiting bodies are formed. Low stringency hybridisation experiments using the pro1 gene as a probe suggested that a homologue might exist in A. nidulans. Therefore, we have screened the genomic DNA database of A. nidulans and identified two genes whose translation products shared sequence similarities to Pro1. We analysed the function of these Zn(II)2Cys6 transcription factors. |
| Databáze: | OpenAIRE |
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