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Als Hauptaufgabe von B-Lymphozyten wurde lange Zeit ihre Differenzierung zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen betrachtet. In den letzten Jahren rückte jedoch vermehrt die immunregulatorische Funktion von B-Zellen in den Vordergrund. 2006 wurden durch die Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Jahrsdörfer zum ersten Mal regulatorisch aktive B-Zellen, die die zytotoxische Serinprotease Granzym B exprimieren, beschrieben. Diese Granzym B-positiven B-Zellen können in vitro durch eine Stimulation von B-Zellen mit Interleukin-21 und einem polyklonalen Antikörpergemisch, welches gegen den B-Zell-Rezeptor gerichtet ist, induziert werden. Auch in vivo kann in Anwesenheit unvollständig aktivierter T-Helferzellen eine solche Induktion von B-Zellen zu Granzym B-positiven Zellen beobachtet wer-den, wie etwa im Fall akuter Infektionen mit dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV). Mittlerweile sind viele nicht-zytotoxische Funktionen von Granzym B bekannt. Verschiedene Untersuchungen deuten darauf hin, dass regulatorische B-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen, bei viralen Infektionen, bei Transplantattoleranz oder bei der Graft-versus-Host-Reaktion spie-len (GvHD). Funktionell konnte Granzym B-positiven B-Zellen (GraB Cells) ein antiproliferativer Effekt auf T-Zellen durch Degradation von Teilen des T-Zell-Rezeptors zugeschrieben werden. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Hypothese, dass bei bestimmten Erkrankungen Granzym B-sezernierende B-Zellen zu einer Regression der Krankheitsaktivität führen können. Umgekehrt impliziert diese Hypothese aber auch, dass die Hemmung von GraB Cells ebenfalls von therapeutischem Interesse sein könnte, wenn zum Beispiel - wie bereits nachgewiesen - Tumoren mit Granzym B-positiven B-Zellen infiltriert sind. Ziel dieser Dissertation war die Generierung und Modulation Granzym B-exprimierender regulatorischer B-Zellen unter Verwendung „Good Manufacturing Practice“ (GMP)-konformer Arbeitsschritte und – soweit möglich – entsprechender Materialien, um in Zukunft ihre zelltherapeutische Nutzung möglich zu machen. Dabei wurden verschiedene Modulierungsmöglichkeiten untersucht, welche die Granzym B-Expression der B-Lymphozyten entweder steigern oder inhibieren. Hierzu wurden B-Lymphozyten aus Vollblutspenden und Leukozytapheresaten mittels magnetischer Zellseparation isoliert und mit Interleukin 21 und einem Antikörpergemisch, welches den B-Zell-Rezeptor aktiviert, stimuliert. Auf dieser Basis wurden dann verschiedene Stimulationsbedingungen bezüglich Stimulanzien, Supplementen und Weiterverarbeitungszeiten getestet. Die Auswertung erfolgte mittels Oberflächen- und Intrazellulärfärbung sowie Durchflusszytometrie. Albumin und fetales Kälberserum erwiesen sich als induktionsfördernd auf die Granzym B-Expression in B-Zellen, humanes Serum und Immunglobulinpräparate hingegen als induktionshemmend. Des Weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal die Induktion Granzym B-positiver B-Zellen aus Leukozytapheresaten durchgeführt. Hierbei wurden vergleichbare Ergebnisse zu aus Vollblut isolierten B-Lymphozyten erzielt. Insbesondere konnte kein relevanter Einfluss einer Antikoagulation mit Acid-Citrate-Dextrose (ACD) oder Citrat sowie einer Lagerung der Leukozytapheresate von bis zu vier Stunden vor Weiterverarbeitung auf die Viabilität und Funktionalität resultierender GraB Cells festgestellt werden. Insgesamt könnten die Ergebnisse dieser Dissertation dazu beitragen, dem Ziel der Herstellung eines Zelltherapeutikums aus regulatorischen B-Zellen, insbesondere hinsichtlich Materialien und Verarbeitung, einen bedeutenden Schritt näherzukommen. Es erscheint realistisch, dass eine GMP-konforme Induktion von GraB Cells in ausreichenden Zahlen möglich ist, um in Zukunft bei verschiedenen inflammatorischen Erkrankungen wie der GvHD als Zelltherapeutikum eingesetzt werden zu können. |
