Bioprozessanalytik mittels Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie
Autor: | Schalk, Robert |
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Přispěvatelé: | Methner, Frank-Jürgen, Beuermann, Thomas, Technische Universität Berlin, Neubauer, Peter |
Jazyk: | němčina |
Rok vydání: | 2019 |
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DOI: | 10.14279/depositonce-7823 |
Popis: | Die Echtzeitüberwachung von Reaktionsprozessen mit Hilfe der optischen Spektroskopie hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Dabei sind insbesondere die Raman- und Mittelinfrarot- (MIR-) Spektroskopie für die spezifische Detektion von Molekülen geeignet, da beide Methoden auf der Anregung von Grundschwingungen basieren. Diese analytischen Methoden sind nicht-invasiv, schnell und ermöglichen zudem die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Analyten ohne Probennahme bzw. -aufbereitung. Typische spektroskopische Messaufbauten für die Prozessüberwachung in der Flüssigphase bestehen dabei aus einem Spektrometer, einer Lichtquelle und einer faseroptischen Immersionssonde (Tauchsonde) welche in direktem Kontakt zum untersuchten Prozess steht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Raman- und MIR-Systeme für die In- bzw. Online-Überwachung von Analyten (z.B. Glucose) während aerober Batch-Fermentationen von S. cerevisiae angewendet sowie deren Vor- und Nachteile in Bezug auf eine Prozessimplementierung in der chemischen und biotechnologischen Industrie diskutiert. Das erste Beispiel ist die gleichzeitige Prozessüberwachung mit kommerziellen Raman- und MIR-Spektrometeraufbauten zur Bestimmung der zeitlichen Konzentrationsverläufe von Glucose, Ethanol und Biomasse. Um die gemessenen Raman-Intensitätsspektren und die MIR-Absorptionsspektren den entsprechenden Analytkonzentrationen zuzuordnen, wurden Multiple Lineare Regressions- (MLR) und Partial Least Squares (PLS) Regressionsmodelle erstellt. Zur Kalibration und als Referenzanalytik für die Bestimmung der Ethanol- und Glucosekonzentrationen dienten HPLC-Analysen der aus dem Reaktor entnommenen Proben, wobei die Biomasse gravimetrisch bestimmt wurde. Dabei waren die PLS-Modelle den vergleichsweise einfachen aber analytspezifischen MLR-Modellen, welche jedoch zur Simulation von Photometer- bzw. Sensorsystemen verwendet werden können, überlegen. Für eine bestimmte multivariate Analysenmethode (MLR oder PLS) lagen die Kalibrations- (RMSEC) und Vorhersagefehler (RMSEP) für beide spektroskopische Methoden in der gleichen Größenordnung. Die Fermentationsüberwachung mit Hilfe der MIR-Spektroskopie in Kombination mit PLS-Modellen resultierte in Vorhersagefehlern von 0,68 g L–1 (2 % relativer Fehler), 0,48 g L–1 (5 %) und 0,37 g L–1 (2 %) für Glucose, Ethanol und Biomasse. Für die Raman-Spektroskopie betrugen die entsprechenden RMSEP-Werte 0,92 g L–1 (3 %), 0,39 g L–1 (4 %) und 0,30 g L–1 (2 %). Das zweite Beispiel demonstriert die Anwendung eines im PI-Institut entwickelten Vierkanal-MIR-Sensors, welcher auf der Methode der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) beruht und für die gleichzeitige Verfolgung von Glucose und Ethanol in der Flüssigphase eingesetzt wurde. Der MIR-ATR-Sensor besteht aus einem gepulsten IR-Strahler als Lichtquelle, einem ATR-Prisma aus Zinkselenid und vier Thermopiles, wobei jeder dieser thermischen Detektoren mit einem optischen Bandpassfilter ausgestattet ist. Die Prozesstauglichkeit des Sensors wurde dabei mit einem Fourier-Transformations- (FT-) MIR-Spektrometer verglichen, wobei die gesamte Messdatenerfassung bei beiden Systemen online in einem Bypass erfolgte. Die Kalibration von Sensor und Spektrometer erfolgte mit Hilfe der MLR. Für den Sensor betrugen die Vorhersagefehler 6,15 g L–1 (6 % relativer Fehler) und 1,36 g L–1 (5 %) für Glucose und Ethanol. Mit dem FT-MIR-Spektrometer wurden RMSEP-Werte von 4,34 g L–1 (4 %) und 0,61 g L–1 (2 %) erzielt. Die Vorteile solcher optischen Mehrkanal-Mittelinfrarot-Sensoren im Vergleich zu FT-MIR-Spektrometeraufbauten sind die Kompaktheit, die einfache Prozessimplementierung sowie der niedrigere Preis. Das dritte Beispiel zeigt den Einsatz einer ebenfalls im PI-Institut entwickelten Ramansonde welche eine kontaktlose Inline-Messung durch optische Schaugläser oder Glasmäntel von Fermentern und chemischen Reaktoren ermöglicht. Eine solche Sonde wurde konzipiert, um potentielle Probleme bei der Implementierung von Standard-Immersionssonden wie Kontamination, Biofilmbildung an der Sondenspitze und hohe Installationskosten in industriellen Anlagen zu vermeiden. Die praktische Einsatzfähigkeit der Ramansonde wurde bei der gleichzeitigen Überwachung des Glucoseabbaus und der Bildung des Produkts Ethanol getestet. Um zusätzlich Sensor-Aufbauten anstelle von kostenintensiven Spektrometersystemen zu simulieren, wurden zur Auswertung der Raman-Spektren MLR-Modelle verwendet, wodurch die spektralen Informationen auf Intensitäten in wenigen analytspezifischen Bereichen limitiert wurden. Die Vorhersagefehler für Glucose und Ethanol betrugen etwa 5 g L–1 (5 % relativer Fehler) und 1 g L–1 (3 %). Die vorgestellte kontaktlose Ramansonde ermöglicht eine einfache Adaption an eine Vielzahl von Prozessen in der chemischen und biotechnologischen Industrie. Anhand der drei vorgestellten Beispiele werden die erzielten Resultate mit einem detaillierten Überblick zu aktuellen Analysesystemen ergänzt und neueste Entwicklungen im Bereich der Raman- und MIR-ATR-Spektroskopie für die Echtzeitüberwachung von Fermentationsprozessen beschrieben. Real-time monitoring of reaction processes using optical spectroscopy has gained importance over the past few years. Thereby, Raman and mid-infrared (MIR) spectroscopy are useful tools for the specific detection of molecules, since both methods are based on the excitation of fundamental vibration modes. These analytical techniques are non-invasive, fast and enable simultaneous determination of multiple analytes without sample preparation. Typical spectroscopic setups for process monitoring in the liquid phase consist of a spectrometer, a light source, and a fiberoptic immersion probe in direct contact to the process. In this work, different Raman and MIR systems were applied for in-line/on-line measurement of analytes (e.g. glucose, ethanol etc.) during aerobic batch-fermentations of S. cerevisiae. Furthermore, their advantages and disadvantages are discussed with regard to process implementation in the chemical and biotechnological industry. The first example is the simultaneous process monitoring using commercial Raman and MIR spectroscopic setups for recording the temporal concentration courses of glucose, ethanol, and biomass. In order to link the Raman intensity spectra and the MIR absorption spectra to the analyte concentrations multiple linear regression (MLR) and partial-least squares (PLS) regression models were developed. For reference analysis, high performance liquid chromatography (HPLC) and gravimetry was used. PLS models were superior to the simple but analyte specific MLR models, which could also be used to simulate photometer setups. For a given multivariate calibration method (MLR or PLS) the calibration (RMSEC) and prediction (RMSEP) errors for both spectroscopic methods were similar. Process monitoring using MIR spectroscopy in combination with PLS models yielded in RMSEP values of 0.68 g L–1 (2 % relative error), 0.48 g L–1 (5 %) and 0.37 g L–1 (2 %) for glucose, ethanol and biomass. In the case of Raman spectroscopy the corresponding prediction errors were 0.92 g L–1 (3 %), 0.39 g L–1 (4 %) and 0.30 g L–1 (2 %), respectively. The second example demonstrates the application of a newly low-cost four-channel MIR sensor using the attenuated total reflection (ATR) technique for simultaneous real-time monitoring of glucose and ethanol. The MIR-ATR sensor was developed at the PI-Institute and consists of an IR emitter as light source, a zinc selenide ATR prism as boundary to the process, and four thermopile detectors, each equipped with an optical bandpass filter. The performance of the sensor was compared to a Fourier transform (FT-) MIR spectrometer by on-line measurements in a bypass loop. Sensor and spectrometer were calibrated by MLR. The prediction errors using the sensor were 6.15 g L–1 (6 % relative error) for glucose and 1.36 g L–1 (5 %) for ethanol. In the case of the FT-MIR spectrometer, the corresponding RMSEP values were 4.34 g L–1 (4 %) and 0.61 g L–1 (2 %), respectively. The advantages of optical multi-channel mid-infrared sensors in comparison to FT-MIR spectrometer setups are the compactness, easy process implementation and lower price. The third example shows the suitability of a non-contact Raman probe which was developed at the PI-Institute. The design of the probe enables in-line measurements through glass vessels or inspection glasses of bioreactors and chemical reactors. This probe has the advantage to avoid potential problems regarding the implementation of commercially available immersion probes like contamination, biofilm formation on the probe tip and high installation costs in industrial plants. The practical applicability of the probe was tested by monitoring the consumption of the substrate glucose and the formation of the product ethanol. To evaluate Raman spectra MLR models were applied to simulate fictive Raman photometer setups instead of expensive spectrometer systems by limiting the spectral information to intensities in specific regions. The prediction errors for glucose and ethanol were approx. 5 g L–1 (5 % relative error) and 1 g L–1 (3 %), respectively. The presented Raman probe allows simple adaption to a wide range of processes in the chemical and biotechnological industries. Based on the results of these three examples a detailed overview about state-of-the-art techniques and recent developments in Raman and MIR-ATR-Spectroscopy for real-time monitoring of fermentation processes is given. |
Databáze: | OpenAIRE |
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