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CpG-reiche DNA, insbesondere bakterielle DNA, stellt durch die Aktivierung von Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) einen Stimulus für das angeborene Immunsystem dar. Dieser Stimulus kann durch synthetische Oligodesoxynukleotide (ODN), welche ein zentrales CpG-Motiv beinhalten (CpG-ODN), nachgestellt werden. Die strukturellen Einzelheiten der CpG-Erkennung sind jedoch weitestgehend unbekannt. Es wurde gezeigt, dass stimulative CpG-ODN nützlich sind, um Immunantworten bei Allergien, Infektionen und Krebs zu beeinflussen. Kürzlich wurde berichtet, dass die Stimulation von TLR9 durch endogene DNA zur Pathogenese von Autoimmunkrankheiten beitragen könnte. In dieser Arbeit wurden die funktionellen und strukturellen Wechselwirkungen zwischen Ligand und Rezeptor genauer analysiert. Hierzu wurden Mutationsstudien in der TLR9 Extrazellulärdomäne (ECD) und die Analyse strukturell modifizierter ODN durchgeführt. Die ECD von TLR9, welche die Ligandenbindung vermittelt, besteht aus 25 Leucin-rich repeat (LRR) Motiven. Fünf der LRRs tragen Insertionen, welche nicht mit dem LRR-Konsensus-Motiv übereinstimmen. Hier wurde gezeigt, dass die funktionelle Integrität der TLR9-ECD durch die Deletion einzelner LRR-Motive zerstört wird. Durch Deletion der inserierenden Sequenzen selbst konnte beobachtet werden, dass LRR2, LRR5 und LRR8 zur Rezeptoraktivierung durch CpG-ODN beitragen. Diese Deletionen zeigten keinen Einfluss auf die Rezeptordimerisierung, inhibierten jedoch die Bindung von CpG-DNA. Darüber hinaus wurde die Bedeutung eines Nukleinsäure bindenden Motivs innerhalb der Insertion von LRR8 bestätigt. Basierend auf einem Homologiemodell wurde ein positiv geladener Bereich im N-Terminus identifiziert, welcher für die CpG-induzierte TLR9-Aktivierung ebenfalls essentiell ist. Diese Interaktionen entsprechen Befunden, welche für die strukturelle Erkennung von doppelsträngiger RNA durch TLR3 erhoben wurden, und deuten somit auf ein generelles Prinzip der Nukleinsäureerkennung durch TLRs hin. Durch die Analyse von modifizierten, synthetischen Phosphodiester CpG-ODN konnte gezeigt werden, dass CpG-ODN höchstwahrscheinlich in partiell doppelsträngiger Konformation, die aufgrund der Ausbildung intermolekularer Duplexstrukturen vorliegt, erkannt werden. Strukturen, die eine intramolekulare Duplexbildung förderten, inhibierten die CpG-Aktivität nicht. Des Weiteren wurde gezeigt, dass multimerisierende ODN, welche eine 5’-Aminomodifikation enthielten, zu einer starken Interleukin 6-Induktion in humanen Immunzellen führten. Zusätzlich wurde ein suppressives Guanosin-reiches ODN (G-ODN) identifiziert, welches die Aktivierung von TLR9 durch stimulative CpG-ODN inhibierte. Das G-ODN war in vitro sowohl in Makrophagen und Dendritischen Zellen als auch in humanen plasmazytoiden Dendritischen Zellen suppressiv. G-ODN inhibierte die Sekretion von Tumor-Nekrosefaktor alpha und Interleukin 12p40 und beeinträchtigte die Hochregulation von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II und von kostimulatorischen Molekülen. G-ODN wirkte auch bei einem molaren Verhältnis von 1:10 (G ODN:CpG-ODN) und noch bei Zugabe sieben Stunden nach der CpG-ODN-Stimulation inhibitorisch. G ODN inhibierte spezifisch TLR9, jedoch keine anderen TLRs. Die Hemmung war von fünf Guanosinen in Folge abhängig und beeinträchtigte das proximale TLR9-Signal. Eine Wirkung von G ODN auf die Aufnahme konnte ausgeschlossen werden. Somit repräsentiert G-ODN eine Klasse von suppressiven ODN, welche in Situationen pathologischer TLR9-Aktivierung, wie es für einige Autoimmunkrankheiten vorgeschlagen wurde, von therapeutischem Nutzen sein könnte. |
