DNA-Microarrays zur Identifizierung von pathoadaptiven Mutationen und Antibiotikaresistenzen in extraintestinal pathogenen Escherichia coli (ExPEC)

Autor: Barl, Timo
Přispěvatelé: Schmid, Rolf D. (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2008
Předmět:
DOI: 10.18419/opus-891
Popis: Gegenstand dieser Arbeit war die Entwicklung von DNA-Microarrays zur Genotypisierung von E. coli für die klinische Diagnostik. Im ersten Teil der Dissertation wurde ein DNA-Microarray zur Detektion der häufigsten pathoadaptiven Mutationen in der Bindeuntereinheit von Typ 1-Fimbrien (FimH), die das Pathogenitätspotential von extraintestinal pathogenen Escherichia coli-Stämmen (ExPEC) erhöhen, entwickelt. Dieser Microarray wurde verwendet, um die fimH-Varianten von 131 E. coli-Isolaten zu genotypisieren. Sämtliche Ergebnisse wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die insgesamt 16 nachgewiesenen verschiedenen Mutationen traten grundsätzlich in Kombination mit der dominanten Mutation V27A auf. Zusätzlich konnten für die hauptsächlich kommensalischen Gruppe A-Stämme die Mutation A202V bzw. für die pathogenen Gruppe B2-Stämme N70S, S78N und R166H als spezifische Marker identifiziert werden. In einem zweiten Teil wurde der vorbeschriebene gyrA-Microarray (Yu et al. 2004) zur Detektion der Fluorchinolonresistenz in E. coli überarbeitet und anschließend mit dem fimH-Microarray in einen Array integriert. Dabei wurden Mutationen an den Aminosäure-Positionen 83 und 87 berücksichtigt, die den ersten Schritt einer stufenweisen Akkumulation von Mechanismen darstellen, die zu einer klinisch relevanten Resistenz führen. Mit dem integrierten Array zur simultanen Detektion der relevanten Mutationen in fimH und gyrA wurden 141 Isolate genotypisiert. Dabei wurde in insgesamt 30 Isolaten mindestens eine resistenzauslösende Mutation nachgewiesen. Bei allen betroffenen Isolaten handelte es sich dabei ausnahmslos um Isolate aus Harnwegsinfektionen. Unter anderem konnte die phänotypische Chinolonresistenz von sechs klinischen Isolaten jeweils auf eine gyrA-Doppelmutation zurückgeführt werden. Zusätzlich wurde gyrA 255C als eine weitere Gruppe A-spezifische Position identifiziert. Die in dieser Arbeit verwendete Technologie der allelspezifischen Hybridisierung erwies sich als äußerst robust und leistungsfähig. Allerdings ist ein grundsätzliches Merkmal der Methode, dass für die unterschiedlichen Sondensätze häufig verschiedene Diskriminierungen zwischen Perfect Match- und Mismatchsonden beobachtet werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass der Einsatz einer mismatchspezifischen Endonuklease (Surveyor Nuclease) zu einer verbesserten Auflösung insbesondere für cytosinhaltige Fehlpaarungen bei einem Oligonukleotidarray führt. Abschließend betrachtet wurden in dieser Arbeit eine Reihe grundlegender Ergebnisse über die allelspezifische Hybridisierung gewonnen: (1) Stille Mutationen in der Ziel-DNA sowie die Einbaurate des Fluoreszenzfarbstoffs hatten einen signifikanten Einfluss auf die absolute Signalintensität, waren jedoch für die Diskriminierung der Varianten unerheblich. (2) Mit einem 22 min dauernden PCR-Programm konnte ausreichend Ziel-DNA amplifiziert werden, um eine eindeutige Genotypisierung durchzuführen. Dies reduzierte die Gesamtdauer des Assays auf dreieinhalb Stunden nach der DNA-Extraktion. (3) Für die Genotypisierung waren 1000 Genomäquivalente als Eingangsmaterial für die PCR ausreichend. (4) Schließlich wurde gezeigt, dass eine Mischpopulation aus zwei fimH-Genotypen bis zu einem 50fachen Überschuss der einen Variante aufgelöst werden konnte.
The aim of this study was the development of DNA microarrays for genotyping Escherichia coli isolates for clinical diagnostics. In the first part of this thesis, a DNA microarray for the detection of the most frequent pathoadaptive mutations in FimH, the binding subunit of type 1 fimbriae, was developed. These polymorphisms increase the pathogenic potential of extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC). This array was employed for genotyping fimH variants of 131 isolates. All results were confirmed by (Sanger-) sequencing. In total, 16 different mutations were discovered amongst those isolates whereas all of them occurred in combination with the dominant mutation V27A. In addition, mutation A202V was specifically identified for commensal strains belonging to ECOR group A and three mutations (N70S, S78N and R166H) were found to be specific markers for pathogenic isolates belonging to group B2. In the second part of this work, the previously described gyrA microarray (Yu et al. 2004) for the detection of quinolone resistance in E. coli was revised and integrated into the fimH microarray. Only mutations at positions GyrA83 and GyrA87 were considered which are known to be the first step of a stepwise accumulation of resistance mechanisms, which are leading to clinically relevant resistance. The integrated array was employed for the simultaneous detection of relevant fimH and gyrA mutations of 141 isolates. In summary, 30 isolates proved to contain at least one resistance causing gyrA mutation whereas all these isolates were isolated of patients suffering from urinary tract infections. Six of these isolates had shown a phenotypic resistance, which could be explained by gyrA double mutations. In addition, gyrA255C was identified as another specific marker for isolates of ECOR group A. Allele-specific hybridization has proven to be a robust and powerful tool for genotyping. However, different sets of probes show diverse discrimination between perfect match and mismatch probes. For the first time, the employment of a mismatch specific endonuclease (Surveyor nuclease) on a solid surface for an improved genotyping was shown in this thesis. In addition, some fundamental observations concerning allele-specific hybridization were made: (1) Silent mutations within the target DNA as well as the incorporation rate of fluorescent dye had a significant influence on the absolute signal intensity, but were irrelevant for the discrimination between allelic variants. (2) A PCR program of 22 min was sufficient for producing enough target material for an unambiguous genotyping. In summary, the total assay time could be reduced to three and a half hours after DNA extraction. (3) The sensitivity of the assay was set to 1000 genome equivalents (4) Finally, a 50 to 1 mixture of two fimH variants could be resolved.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: