Entwicklung und Etablierung einer Methode zur Messung des epithelialen Wassertransports an Claudin-2 exprimierenden MDCK-Zellen

Autor: Oelrich, Beibei
Rok vydání: 2009
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DOI: 10.17169/refubium-12807
Popis: Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde untersucht, ob die Expression von Claudin-2, einem TJ-Protein, das in vivo bevorzugt in lecken Epithelien exprimiert wird und einen parazellulären Kanal für kleine Kationen bildet, einen Einfluss auf den Wassertransport an einer Nierenzelllinie (MDCK-Zellen) hat. Dazu wurde Claudin-2 stabil in MDCK-C7- Zellen transfiziert, die ein Modell für ein dichtes Epithel darstellen und endogen kein Claudin-2 exprimieren. Der Wassertransport an diesen Zellen wurde mit Vektorkontrollen (C7-vec), die nur den leeren Vektor enthielten, mit den Wildtypzellen (C7-wt) und mit MDCK-C11-Zellen (C11-wt), die ein leckes Epithel repräsentieren und endogen stark Claudin-2 exprimieren, verglichen. Für diese Untersuchungen wurde ein Messaufbau entwickelt und etabliert, um den Wassertransport quantitativ zu erfassen. Die vorliegende Arbeit zeigt folgende Ergebnisse: 1\. Der Messaufbau besteht aus einer modifizierten Ussing-Kammer und einem digitalen optisch-elektrischen Kombinationssystem, welches sowohl den transepithelialen Widerstand der Zellen als auch den Wassertransport anhand der Position des Flüssigkeitsmeniskus erfasst. Es ermöglicht somit eine quantitative Messung des Wassertransports an vitalen Epithelien unter physiologischen Bedingungen. 2\. Der Wassertransport in lecken Epithelien bzw. MDCK-C11-wt ist höher als in dichten Epithelien, repräsentiert durch die MDCK-C7-Zellen. 3\. Die Expression von Claudin-2 in hochohmigen C7-Zellen bewirkt eine deutliche Senkung des transepithelialen Widerstandes. Dabei war der Einfluss von humanem Claudin-2 deutlich stärker als der von murinem Claudin-2. 4\. Der Wassertransport kann durch einen osmotischen Gradienten induziert werden und durch einen Gradienten für Natrium zusätzlich verstärkt werden. Der Wassertransport in den mit humanem Claudin-2 transfizierten Zellen ist deutlich höher als in den Vektorkontrollen oder Wildtyp-Zellen. Furuse et al. demonstrierten an MDCK-Zellen, dass durch die Einführung von Claudin-2 ein dichtes Epithel in ein leckes Epithel umgewandelt wird [66]. Amasheh et al. belegten durch Fluxversuche, dass Claudin-2 einen parazellulären Kationen- selektiven Kanal induziert. Dieser Kanal könnte auch den parazellulären Transport von Wasser ermöglichen. Der durch Claudin-2 vermittelte parazelluläre Na+-Transport ist in der Lage, den osmotisch induzierten Wassertransport zusätzlich zu steigern. Folglich kann vermutet werden, dass Claudin-2 am epithelialen Wassertransport beteiligt ist und der Kationen- selektive parazelluläre Kanal auch einen Durchtritt von Wasser ermöglicht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass durch die Expression von Claudin-2 der transepitheliale Wassertransport gesteigert wird. Diese Steigerung ist vermutlich auf eine Erhöhung der parazellulären Permeabilität für Wasser zurückzuführen.
Tight junction proteins, the claudins, determine the properties of the paracellular pathway in epithelial barriers. Claudin-2 is known to enhance the paracellular permeability for cations. To investigate whether the cation permeability was associated with water permeability a novel method was developed and established to measure the transepithelial water transport in a cell culture model. Stable transfected MDCK cell clone expressing the tight junction protein claudin-2 were grown on cell supports and the transepithelial water transport was compared to cells lacking claudin-2. There was a dramatic decrease in transepithelial resistance in claudin-2 expressing cells. The transepithelial water transport in cell clones with claudin-2 was found to be significantly higher than the controls. The expression of other claudins was not altered in the transfected cell clones. In conclusion, the findings indicate that the claudin-2 induces a paracellular pore which is also enhances water transport.
Databáze: OpenAIRE
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