Optimized broad-range real-time PCR-based method for bacterial screening of platelet concentrates
| Autor: | J. S. Malgarin, Fabiana Alexandrino, Luis Gustavo Morello, Marco Aurélio Krieger |
|---|---|
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2020 |
| Předmět: |
Blood Platelets
DNA Bacterial Serial dilution Microbial DNA QH301-705.5 Science 030204 cardiovascular system & hematology Biology Real-Time Polymerase Chain Reaction medicine.disease_cause Bacterial genetics PCR em tempo real 03 medical and health sciences chemistry.chemical_compound bacterial contamination 0302 clinical medicine RNA Ribosomal 16S Escherichia coli medicine Biology (General) contaminação bacteriana 030304 developmental biology Detection limit 0303 health sciences Chromatography molecular testing Bacteria Botany Ribosomal RNA concentrado de plaquetas teste molecular Real-time polymerase chain reaction chemistry QL1-991 QK1-989 platelet concentrates General Agricultural and Biological Sciences real-time PCR Zoology DNA |
| Zdroj: | Brazilian Journal of Biology, Vol 81, Iss 3, Pp 692-700 (2020) Brazilian Journal of Biology, Issue: ahead, Published: 14 AUG 2020 Brazilian Journal of Biology v.81 n.3 2021 Brazilian Journal of Biology Instituto Internacional de Ecologia (IIE) instacron:IIE Brazilian Journal of Biology, Volume: 81, Issue: 3, Pages: 692-700, Published: 14 AUG 2020 |
| ISSN: | 1678-4375 |
| Popis: | Bacterial contamination of blood components remains a major challenge in transfusion medicine, particularly, platelet concentrates (PCs) due to the storage conditions that support bacterial proliferation. In this study, we develop a rapid, sensitive and specific real-time PCR protocol for bacterial screening of PCs. An internally controlled real-time PCR-based method was optimized and validated with our proprietary 16S Universal PCR Master Mix (IBMP/Fiocruz), which targets a conserved region of the bacterial 16S rRNA gene. Nonspecific background DNA was completely eliminated by treating the PCR Master Mix with ethidium monoazide (EMA). A lower limit of detection was observed for 10 genome equivalents with an observed Ct value of 34±1.07 in calibration curve generated with 10-fold serial dilutions of E. coli DNA. The turnaround time for processing, including microbial DNA purification, was approximately 4 hours. The developed method showed a high sensitivity with no non-specific amplification and a lower time-to-detection than traditional microbiological methods, demonstrating it to be an efficient means of screening pre-transfusion PCs. Resumo A contaminação bacteriana dos componentes sanguíneos é um grande desafio na medicina transfusional, principalmente nos concentrados de plaquetas (PCs) devido às condições de armazenamento que favorecem a proliferação bacteriana. Neste estudo, desenvolvemos um protocolo de PCR em tempo real rápido, sensível e específico para a triagem bacteriana de PCs. Um método baseado em PCR em tempo real, controlado internamente, foi otimizado e validado com um Master Mix Universal PCR 16S (IBMP / Fiocruz), que detecta uma região conservada do gene 16S rRNA bacteriano. O background de DNA não específico foi completamente eliminado tratando a PCR Master Mix com monoazida de etídio (EMA). O limite de detecção inferior observado foi de 10 cópias equivalentes do genoma com um valor de Ct 34 ± 1,07, a curva de calibração foi gerada com diluições seriada de 10 vezes do DNA de E. coli. O tempo de processamento, incluindo a purificação microbiana do DNA, foi de aproximadamente 4 horas. O método desenvolvido mostrou alta sensibilidade sem amplificação inespecífica e menor tempo de detecção do que os métodos microbiológicos tradicionais, demonstrando ser um meio eficiente de triagem de PCs pré-transfusionais. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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