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Kardiomyopathie ist ein Sammelbegriff für eine heterogene Gruppe an Herzmuskelerkrankungen, die mit einer elektrischen und/oder mechanischen Dysfunktion einhergehen. Es sind multiple Ätiologien und Pathomechanismen bekannt, wobei genetische Ursachen eine zentrale Rolle spielen. Die beiden häufigsten Formen stellen die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) und die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) dar. In beiden Fällen können Mutationen in Genen, die für bedeutende Bestandteile der Herzmuskelzellen codieren, ursächlich für die Erkrankung sein. Eine dieser Komponenten ist das Protein Nexilin. Bei Patienten mit DCM oder HCM wurden Mutationen in dem codierenden Gen NEXN identifiziert. Auch experimentelle Versuche am Zebrafisch zeigten die Entwicklung eines DCM-ähnlichen Phänotyps durch einen Nexilin-Knockdown. Als Grundlage für eine weitere Erforschung des Proteins Nexilin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine stabile Nexilin-Knockout-Zebrafischlinie generiert. Unter Anwendung des von Bakterien abgeleiteten Genmodifikationssystem CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9) konnten erfolgreich Mutationen im für Nexilin codierenden Gen induziert werden. Diese Mutationen führten über eine Leserahmenverschiebung zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation vermutlich mit Degradierung des fehlerhaften Proteins, was in einem verminderten beziehungsweise aufgehobenen Nachweis von Nexilin im Western Blot sichtbar wurde. Trotz dieses Mangels an Nexilin zeigten die betroffenen Fische keine morphologischen oder funktionellen Auffälligkeiten im Vergleich zu Wildtypfischen wie sie bei den Knockdown-Versuchen zuvor beobachtet worden waren. Diese Diskrepanz zwischen einem pathologischen Phänotyp eines Knockdown-Fisches und einem unauffälligen oder anderen Phänotyp des entsprechenden Knockout-Fisches wird auch von anderen Arbeitsgruppen für verschiedenste Gene beschrieben. Mehrere Erklärungsansätze sind dabei in Betracht zu ziehen. Als aktuell wahrscheinlichste Ursache für den fehlenden Phänotyp der hier generierten Nexilin-defizienten Fische ist die Aktivierung genetischer Kompensationsmechanismen anzusehen. So kann durch einen Gen-Knockout die Expression anderer Gene kompensatorisch angepasst werden. Diesbezüglich sind nun weitere Untersuchungen wie die Analyse des gesamten Proteoms der Knockout-Fische nötig. Dennoch sollte auch die Spezifität der Morpholinos für die Knockdown-Versuche durch Anwendung in der neuen Knockout-Linie überprüft werden, um Off-Target-Effekte als Ursache des beobachteten DCM-Phänotyps auszuschließen. Die Generierung einer weiteren Zebrafischlinie, einer transgenen Nexilin-Linie, scheiterte. Mit Hilfe eines Multisite-Vektors sollte die Expression eines Nexilin-GFP-Fusionsproteins induziert werden. Da die Eizellen lediglich eine geringe Toleranz gegenüber der Konzentration der Injektionslösung zeigten, ergibt sich der Verdacht auf eine toxische Wirkung des Vektors oder durch eine erhöhte Nexilin-Konzentration, wobei bereits zuvor eine Störung der myokardialen Differenzierung durch Nexilin-Überexpression beschrieben worden ist. Zur weiteren funktionellen Charakterisierung von Nexilin wurde ein Fokus dieser Arbeit auf die Validierung bekannter und die Ermittlung unbekannter Interaktionspartner von Nexilin mit Hilfe eines Zellkultursystems gelegt. Dabei konnte die Interaktion zwischen Nexilin und Aktin bestätigt und die Vermutung einer stabilisierenden Funktion von Nexilin auf das Aktinzytoskelett gestellt werden. Nach Behandlung mit Cytochalasin D, einer hemmenden Substanz der Aktinpolymerisation, wiesen Nexilin-transfizierte Zellen im Gegensatz zu nicht-Nexilin-transfizierten Zellen ein weitgehend erhaltenes Aktinzytoskelett auf. Zudem lieferten ein extern durchgeführter Yeast-two-Hybrid-Screen sowie eine Koimmunpräzipitation Hinweise, dass die Proteine Glomulin und CTNNBL1 (Catenin beta like protein 1) mögliche unbekannte Interaktionspartner von Nexilin darstellen. Diesbezüglich sind weitere Schritte zur Verifikation und zur Ermittlung der tatsächlichen biologischen Relevanz erforderlich. Die gewonnen Erkenntnisse und Hypothesen stellen eine Basis für eine weitere Charakterisierung von Nexilin dar, was letztlich zum weiteren Verständnis über die Pathomechanismen von Kardiomyopathien beitragen kann. |
