Quorum sensing- and contact-dependent inhibition-based population control in synthetic microbial communities

Autor: Löchner, Anne Christina, Sourjik, Victor (Prof. Dr.)
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2019
Předmět:
Popis: The utilization of microbial communities instead of single strain populations in biotechnological processes has been under investigation over the last decades. While some natural communities have already for example been employed for the production of fermented food the establishment of synthetic microbial communities for the production of valuable compounds or bioremediation is still under investigation. One of the most important aspects that has to be considered to maintain microbial communities for biotechnological applications stably is to be able to tune growth and growth rate of individual populations to prevent outgrowth and unbalancing of the community. To address this challenge, we aimed to develop a multicellular network in two engineered Escherichia coli populations with which the growth of one population is controlled in a density-dependent manner by the respective other population and vice versa. In Synthetic Biology standardization and modularization represent a key aspect in order to be able to predict the performance of circuits and networks. For this to be possible all the utilized parts needed to be characterized. To get an understanding of gene expression strength as well as the dynamics over time, we characterized the promoters we implemented in our synthetic network. We expressed representatively a fluorescent protein from the promoters and thus monitored the expression of GFP under different conditions. To regulate the population growth in our synthetic microbial community we took three different approaches and investigated their characteristics and suitability to be implemented: 1. Antibiotic resistances 2. RNA polymerase and 3. Contact-dependent inhibition. For the antibiotic resistance, we utilized the chloramphenicol acetyltransferase as a mechanism to regulate population growth. The expression of the corresponding cat gene was placed under the control of a quorum sensing promoter (PluxI or PlasI). While the cognate transcription factor (LuxR or LasR) was expressed in the same cell the cognate communication molecule (acyl-homoserine lactone: AHL) (AHL-C6 or AHL-C12) was produced in cells of the other population. Thus the resistance to chloramphenicol (CAM) should only be conferred by high cell density of the respective other population when enough cognate AHL is produced to induce the gene expression of the resistance cassette. However, our data showed that the cells grew in the presence of CAM, even when no AHL or transcription factor was available. In consecutive rounds of design improvements plasmid backbones, promoters, and also the antibiotic resistance cassette were exchanged for alternative variants or versions but did not result in a system exhibiting the desired performance. This led us to conclude that the implementation of antibiotic resistance cassettes could not achieve the regulation of population growth in bacteria. The RNA polymerase approach was performed by controlling the expression of the rpoBC operon which encodes the β and β’ subunit of the RNA polymerase. Additionally, we replaced the Las quorum sensing system with the Rpa system (RpaR, RpaI, AHL-pC, and Prpa*). First experiments showed that the cells did not exhibit any differences in growth or growth rate in comparison to the wild-type. Therefore, we improved the design by tagging each component with an LVA tag to enhance protein degradation and thus shortening the protein half-life; all genes were also chromosomally integrated to reduce gene copy number. The results showed that the growth and growth rate were reduced; nevertheless, we did not obtain a quorum sensing-dependent growth switch. To conclude, even though the overall aim could not be achieved so far we got valuable insights into quorum sensing-regulated RNA polymerase expression. Implementation of further improvements is promising, and we identified measures which could be taken next in order to design and build a functional RNA polymerase-based system. Additionally, we explored the potential of contact-dependent growth inhibition (CDI) to be utilized in a similar system as previously described. The CDI system is a touch-dependent and receptor-mediated toxin delivery system which can inhibit neighboring cells. We characterized two CDI systems from two E. coli strains, EC93 and EC869, under different culture and induction conditions in coculture with either CDI negative cells or two CDI strains. We observed that CDI is very effective in inhibiting growth however the cells carrying the pore-forming protein toxin exhibited a stronger toxin effect than DNase toxin-carrying cells. We can report that induction type and levels, inoculation ratios, and selected toxins influence the dynamics and changes in community composition over time. We also coupled the expression of CDI to quorum sensing resulting in quite controlled and stable cocultures over the course of 26 hours. Valuable characteristics were determined which lay the foundation for developing downstream applications harnessing these contact-dependent inhibition properties in microbial communities. To conclude, CDI is a very interesting and promising tool for growth regulation that has to be further explored and adapted to be employed in a growth regulating application. To summarize, for all three mechanisms, the antibiotic resistance cassettes, the RNA polymerase, and contact-dependent inhibition we explored their suitability to be employed to regulate population growth in a density-dependent manner. We obtained valuable data exhibiting the difficulties yet potentials of each system and how they can be further improved to obtain the desired systems performance.
Die Verwendung mikrobieller Gemeinschaften anstelle von Einzelpopulationen in biotechnologischen Prozessen wurde im letzten Jahrzehnt erforscht. Während einige mikrobielle Gemeinschaften bereits zur Produktion fermentierter Lebensmittel eingesetzt wurden, wird die Etablierung synthetischer mikrobieller Gemeinschaften für die Produktion wertvoller Stoffe oder für die biologische Dekontamination noch untersucht. Ein sehr wichtiger Aspekt, um beständig dauerhaft mikrobielle Gemeinschaften für biotechnologische Anwendungen aufrecht zu erhalten, ist die Fähigkeit, das Wachstum und die Wachstumsrate der individuellen Populationen beeinflussen zu können. So sollen übermäßigem Wachstum und Ungleichgewicht in der Gemeinschaft vorgebeugt werden. Um diese Problematik zu adressieren, haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein multizelluläres Netzwerk zwischen zwei gentechnisch veränderten Escherichia coli Populationen zu entwickeln, mit dem das Wachstum der einen Population dichteabhängig von der anderen Population kontrolliert wird und umgekehrt. In der Synthetischen Biologie spielen Standardisierung und Modularisierung eine wichtige Rolle, um Vorhersagen machen zu können, wie sich genetische Schaltkreise und Netzwerke verhalten werden. Damit dies umgesetzt werden kann, müssen alle verwendeten genetischen Bausteine charakterisiert werden. Um einen Einblick in die Genexpressionsstärke sowie die Dynamiken über die Zeit zu bekommen, haben wir das Verhalten der in unserem synthetischen Netzwerk verwendeten Promotoren charakterisiert. Zur Regulierung des Populationswachstums in unserer synthetischen mikrobiellen Gemeinschaft haben wir drei Ansätze verfolgt und Eigenschaften der Mechanismen untersucht, um ihre Eignung für unser System zu testen: 1. Antibiotikaresistenzen 2. RNA Polymerase und 3. Kontaktabhängige Hemmung. Für die Antibiotikaresistenzen haben wir die Chloramphenicol Acetyltransferase als Wachstumsregulationsmechanismus verwendet. Die Expression des korrespondierenden cat Gens wurde durch einen Quorum sensing Promoter (PluxI oder Plas) kontrolliert. Während der zugehörige Transkriptionsfaktor (LuxR oder LasR) in derselben Zelle exprimiert wurde, wurde das zugehörige Kommunikationsmolekül (Acyl-Homoserin-Lacton: AHL) (AHL-C6 oder AHL-C12) in Zellen der jeweils anderen Population produziert. Demnach sollte die Resistenz gegen Chloramphenicol nur gewährleistet sein, wenn die jeweils andere Population in hoher Zelldichte vorliegt und dementsprechend genügend zugehöriges AHL produziert wird, um die Genexpression der Resistenzkassette zu aktivieren. Jedoch haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass die Zellen in chloramphenicolhaltigem Medium wachsen können, auch wenn kein AHL oder Transkriptionsfaktor verfügbar ist. In aufeinanderfolgenden Zyklen wurde das Netzwerkdesign verbessert, es wurden Plasmidvektoren, Promotoren sowie die Antibiotikaresistenz durch Alternativen ersetzt; durch die Änderungen erhielten wir jedoch kein System, das die gewünschten Merkmale aufzeigt. Das führte zu der Erkenntnis, dass die Regulierung des Wachstums einer bakteriellen Population nicht durch die Implementierung einer Antibiotikaresistenzkassette erreicht werden kann. Der RNA Polymerase Ansatz wurde durch die kontrollierte Expression des rpoBC Operons erreicht, welches für die β und β’ Untereinheit der RNA Polymerase kodiert. Zudem haben wir das Las Quorum sensing System durch das Rpa System ersetzt (RpaR, RpaI, AHL-pC and Prpa*). Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass das Zellwachstum und die Wachstumsrate im Vergleich zu Wildtypzellen keinen Unterschied aufweisen. Daher haben wir unser Design verbessert und jede Komponente mit einem LVA-Tag versehen, um den Proteinabbau zu steigern und somit die Proteinhalbwertszeit zu verkürzen. Außerdem wurden alle Gene chromosomal integriert, um die Anzahl der Genkopien zu reduzieren. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass das Wachstum und die Wachstumsrate reduziert werden konnten; jedoch haben wir keinen Quorum sensing abhängigen Wachstumsschalter erhalten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass obwohl das Gesamtziel bisher nicht erreicht werden konnte, wir nützliche Erkenntnisse für die Quorum sensing regulierte RNA Polymerase Expression erhalten haben. Die Implementierung weiterer Verbesserungsansätze ist vielversprechend und wir haben bereits Maßnahmen identifiziert, die umgesetzt werden könnten, um ein funktionierendes RNA Polymerase basiertes Expressionssystem zu entwickeln. Zusätzlich wurde das Potential der kontaktabhängigen Wachstumshemmung (CDI) für die Nutzung in einem wie oben beschriebenen System untersucht. Das CDI System ist ein berührungsabhängiges und rezeptorvermitteltes Toxinliefersystem, das das Wachstum benachbarter Zellen hemmen kann. Wir haben zwei CDI Systeme von zwei E. coli Stämmen, EC93 und EC869, unter verschiedenen Kultur- und Induktionsbedingungen in Kokultur mit nicht-CDI Zellen oder mit zwei CDI Stämmen charakterisiert. Wir haben beobachtet, dass CDI sehr effektiv das Wachstum hemmen kann, jedoch zeigten Zellen, die ein porenformendes Toxin produzieren, einen stärkeren Toxineffekt aufwiesen als DNase Toxin tragende Zellen. Wir können berichten, dass Induktionsart und -level sowie Inokulationsverhältnisse und ausgewählte Toxine die Dynamik und Veränderungen in der Gemeinschaftszusammensetzung über die Zeit beeinflussen. Zudem haben wir die Expression von CDI an Quorum sensing gekoppelt, was zu relativ kontrollierten und stabilen Kokulturen über einen Zeitraum von 26 Stunden geführt hat. Wertvolle Eigenschaften konnten ermittelt werden, welche die Voraussetzungen schaffen für die Entwicklung weiterführender Anwendungen, die sich diese kontaktabhängigen wachstumshemmenden Eigenschaften in mikrobiellen Gemeinschaften zunutze machen. Abschließend lässt sich sagen, dass CDI ein sehr interessanter und vielversprechender Mechanismus für die Wachstumsregulierung ist, der tiefergehend untersucht und angepasst werden kann, um in einer wachstumsregulierten Anwendung zum Einsatz zu kommen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir alle drei untersuchten Mechanismen, die Antibiotikaresistenzkassette, die RNA Polymerase und die kontaktabhängige Wachstumshemmung auf ihre Eignung zur Wachstumskontrolle von Populationen auf eine dichteabhängige Weise hin untersucht haben. Wir haben nützliche Datensätze erhalten, die die Schwierigkeiten aber auch das Potential jedes Systems aufweisen und wie diese weiter verbessert werden können, um ein System mit der erwünschten Leistung zu erhalten.
Databáze: OpenAIRE
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