Do All Roads Really Lead to Rome? Learnings from Comparative Analysis using SPR, NMR, & X-Ray Crystallography to Optimize Fragment Screening in Drug Discovery

Autor: Hassaan, Engi, Klebe, Gerhard (Prof. Dr.)
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2019
Předmět:
Popis: Es gibt mehrere biophysikalische Methoden, um schwach bindende Fragmente an einem Zielprotein schnell zu identifizieren. Als eine Methode darunter liefert die Röntgenkristallographie strukturelle Informationen, die für die Optimierung von Fragmenten entscheidend sind. Dabei gibt es mehrere Kriterien, die für ein erfolgreiches Fragmentscreening erfüllt sein müssen, einschließlich der aufwändigen Herstellung von durchtränkbaren („soakable“) und gut streuenden Kristallen. Daher wäre es äußerst vorteilhaft, eine zuverlässige Kaskade von Screening-Methoden zu haben, die vor der arbeitsintensiven Röntgenkristallographie zur Vorselektion eingesetzt werden können. Diese würden das Aussortieren (oder Filtern) von Verbindungen im Laufe des Screenings ermöglichen, sodass nur die vielversprechendsten Treffer übrigblieben. Aber welche Methode sollte diejenige sein, mit der die Screening-Kaskade gestartet wird? In dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten von Fragmentbibliotheken gegen drei verschiedene Proteine durchgemustert, und zwar tRNA-Guanin- Transglykosylase (TGT), ein wichtiges Zielprotein bei Shigellose, das membranassoziiertes Protein Peroxin 14 (PEX14) von T. Brucei und Endothiapepsin (EP), eine repräsentative Aspartylprotease, um zu untersuchen, ob verschiedene Screening-Methoden ähnliche Gruppen von vermeintlich bindenden Substanzen aufdecken können. Die detaillierte vergleichende Analyse der Ergebnisse der verschiedenen Methoden wird in dieser Arbeit diskutiert. Die Shigellose, eine akute bakterielle Infektion des Darms, wird durch die Gram-negativen Shigella- Bakterien verursacht. Ihre Pathogenität hängt von Virulenzfaktoren (VirF) ab, deren ungestörte Funktion für die Invasion von Epithelzellen erforderlich ist. Die Expression dieser VirFs wird durch das Enzym TGT moduliert. Zu den Strategien, die zur Hemmung von TGT entwickelt wurden, gehören potente Inhibitoren des aktiven Zentrums, welche die Bindung von tRNA blockieren und so die Transkription der Virulenzfaktoren verhindern. Unsere 96-Fragment-Bibliothek wurde, wie in Kapitel 2 beschrieben, mittels SPR, NMR und Röntgenkristallographie auf TGT untersucht. Insgesamt 81 Fragmente wurden mit der SPR-Methode in einem „Direct Binding Assay“-Ansatz untersucht, was eine Trefferquote von 12% ergab. Insgesamt 77 Fragmente wurden mittels NMR untersucht, was zu einer Trefferquote von 29% führte. Hochauflösende Kristallstrukturen wurden auch für die gesamte Fragmentbibliothek durch Tränken der Kristalle mit den entsprechenden Fragmentlösungen ermittelt, was eine Trefferquote von 8% ergab. Beim Vergleich aller gefundenen Fragment-Treffer wurden keine übereinstimmenden Treffer für alle drei Methoden gefunden. Dafür sind mehrere Faktoren verantwortlich, wie z.B. der Ausschluss mancher Fragmente von einzelnen Screens aus technischen Gründen. Im Einzelnen wurden vier Röntgentreffer aus dem SPR- und NMR-Screening ausgeschlossen, zwei SPR-Treffer aus dem NMR-Screening verworfen und fünf NMR-Treffer wurden nie mit in das SPRScreening einbezogen. SPR und NMR sind derzeit die am häufigsten angewandten primären Fragment- Screening-Techniken, aber unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sie, wenn sie als einleitende Methoden einer Screening-Kaskade angewandt worden wären, drei potentiell bindende Substanzen übersehen hätten, die von einem später angewandten, aufwändigeren kristallographischen Filter entdeckt wurden. Die Röntgenkristallographie ermöglicht die Detektion spezifisch bindender Substanzen, die allerdings zu schwach binden, um durch SPR und NMR detektiert zu werden. Sie liefern aber dennoch valide Strukturinformationen, um geeigneten Ansatzpunkten für eine Leitstruktur- Entwicklung abzugeben. Darüber hinaus haben MD-Simulationen des apo-Wildtyp TGTs die Öffnung einer transienten Nebentasche oberhalb der Guanin/preQ1-Tasche vorhergesagt. Basierend darauf wurde eine Strategie zur Ausrichtung dieser neuen Bindungsstelle für das Design neuer Inhibitoren gegen TGT nach einem strukturbasierten Wirkstoffdesign-Konzept entwickelt, welches in Kapitel 2.3 diskutiert wird. Die humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT), auch bekannt als Schlafkrankheit, ist eine vektorübertragene parasitäre Krankheit, die durch T. brucei verursacht und durch Stiche der Tsetsefliege auf den Menschen übertragen wird. T. brucei fehlt es an einer rückgekoppelten allosterischen Regulation der frühen Schritte in der Glykolyse, sie verfügen aber über die relevanten Enzyme in abgetrennten Organellen, die Glykosome genannt werden. PEX14, ein Peroxinprotein, welches für die Biogenese der Glykosome essenziell ist, bildet eine wichtige Protein-Protein- Interaktion mit PEX5, einem Importrezeptor, der zytoplasmatische glykosomale Enzyme in das Organell transportiert. Die Störung der PEX14/PEX5-Interaktion führt zur Anhäufung von glykosomalen Enzymen im Zytosol, damit zum Abbau von ATP, zur Glukosetoxizität, zum metabolischen Zusammenbruch und am Ende zum Tod von T. brucei. Diese Unterbrechung der Interaktion kann durch kleine Moleküle erreicht werden, die an PEX14 binden, und so die Bindung von PEX5 an PEX14 verhindern. Ein initiales NMR-Screening einer Fragmentbibliothek führte zu Fragment-Treffern, die an die N-terminale Domäne (NTD) von T. brucei PEX14 binden. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die NMR-Treffer durch Röntgenkristallographie durch Tränkexperimente zu validieren, um die räumlichen Wechselwirkungen der Fragmente sichtbar zu machen. Die vielversprechenden Fragment- Treffer könnten dann zu potenteren Leitsubstanzen optimiert werden. Die Kristallisation des NTD PEX14 mit einer mutierten Variante im ersten Rest (E1W) zeigte blockierte Bindetaschen, wie in Kapitel 3 beschrieben wird. Das hineinmutierte Tryptophans diente dem Zweck, das kurze NTD-Konstrukt mit fluoreszierende Eigenschaften zu versehen, denn dem nativen Protein fehlen fluoreszierende Aminosäuren. Es wurde jedoch festgestellt, dass dieses angefügte Tryptophan die Bindungstaschen seiner benachbarten Kristallpartner im Proteinkristall blockiert, was diese Kristallform für die Tränkungsversuche ungeeignet macht. Versuche, neue Kristallformen mit freien Taschen zu finden, blieben erfolglos, da die geringe Größe des Proteins und die hydrophobe Natur des Tryptophans dicht gepackte Proteinkristalle entstehen lässt, die wechselseitig die Bindungstaschen benachbarter Kristallpartner blockierten. Virtuelles Screening zur Entdeckung neuartiger Liganden für die Co- Kristallisation ergab einen Liganden, der die Kristallisation der E1W PEX14-Variante in eine leicht geänderte Packung unter Erhalt der Raumgruppensymmetrie überführt. Dadurch entstand eine Kristallform, die sich für die Tränkungsexperimente in Fragment-Lösungen geeignet erwies. Sie erlaubte die Bindung von zwei weiteren Fragment-Treffern in anderen Bindetaschen. Weiterhin konnte die Wildtypform von PEX14 kristallisiert werden, welcher der Tryptophanrest fehlt und welche somit in der Packung unbesetzte Bindungstaschen aufweist. Dies ermöglichte das Eindiffundieren eines bereits zuvor synthetisch dargestellten Leitstrukturvorschlags. Es wurde eine Kristallstruktur des Komplexes bei einer Auflösung von 1,8 Å erhalten, in der der Ligand mehrere Taschen der PEX5- Bindestelle besetzt. Dies unterstreicht die Machbarkeit von Wildtyp-PEX14-Kristallen und deren Eignung für ein weiteres Fragmentscreening. Endothiapepsin ist ein Mitglied der pepsinähnlichen Aspartylproteasen, die für die hydrolytische Spaltung von Peptidsubstraten verantwortlich sind. Aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit anderen pharmakologisch relevanten Aspartylproteasen dient es als Modellenzym für die Untersuchung ihres Mechanismus und das Auffinden erster Leitstrukturen. In früheren Arbeiten anderer Mitglieder unserer Arbeitsgruppe zur Identifizierung und Charakterisierung von Endothiapepsin-bindenden Fragmenten wurde die Röntgenkristallographie als primäre Screening-Methode herangezogen und ihr Potenzial zu identifizieren von Treffern mit mehreren biochemischen und biophysikalischen Screening- Methoden verglichen. Die untersuchte Fragmentbibliothek wurde für ein allgemeines Screening konzipiert und enthielt 361 Einträge. Der Vergleich der Trefferraten der verschiedenen Methoden mit denen der Röntgenkristallographie ergab eine nur geringe Überschneidung, wobei die RDA die höchste Überschneidung bei 7% und MS die niedrigste Überschneidung bei 1% aufweist, gefolgt von STD NMR mit 3%. Um die Gründe für die geringen Überschneidungen zu verstehen, wurden zwei dieser Screening-Techniken für eine genauere Analyse ausgewählt, wie in Kapital 4 beschrieben. Dazu wurden die 71 röntgenkristallographisch detektierten Fragment-Treffer selektiert und mit STD-NMR unter leicht unterschiedlichen Pufferbedingungen sowie mit WaterLOGSY NMR-Experimenten erneut durchmustert. Dieser zweite STD NMR Screen erkannte fast die doppelte Anzahl von Treffern als die erste, und der Water LOGSY Screen hatte mit 69% die höchste Korrelation zwischen den NMR Methoden und den Vorschlägen aus der Kristallographie. Diese vergleichende Analyse zeigte auch, dass Fragmente durch den Einsatz so genannter Reporterliganden nicht, wie gewünscht, räumlicher verdrängt sondern teilweise verschoben werden und dass nicht-deuteriertes Wasser in STD NMR zu falschen Negativen führen kann. Die gesamte 361 Fragment-Bibliothek wurde mittels SPR unter Invertieren des Messprinzips (so genannter „inhibition solution assay“) durchgemustert und als weitere biophysikalische Methode unserer vergleichenden Analyse hinzugefügt. Die erlaubt uns einen weiteren Einblick zu erkennen, welche Bedingungen beim Transfer zwischen verschiedenen Techniken unbedingt eingehalten werden müssen. Die resultierende Trefferrate aus SPR betrug 34%, was einer Überlappung von 11% mit den kristallographischen Treffern entspricht – somit der höchsten Korrelation zwischen den bisher von uns eingesetzten Screeningverfahren. Schließlich haben wir auch die Fragmenttreffer-Erkennung im Rahmen des so genannten „Cocktailing“ für Ergebnisse mit der Kristallographie im Vergleich zu der NMR-Methode untersucht. Dabei ergab sich, dass das „Cocktailing“ in der Kristallographie zu falschen negativen Treffern aufgrund der Kompetition von Fragmenten um den gleichen Bindeplatz führen kann oder abweichende Bindungsmodi für ein bestimmtes Fragment anzeigt werden als diese bei Einzelbestimmungen ermittelt wird. Was die NMRMethode betrifft, so ist trotz der Fähigkeit, konkurrierende Bindungen von Fragmenten im dynamischen Prozess als Bindupngsereignisse nebeneinander zu beobachten, nicht immer gewährleistet. In ca. 20% der von uns untersuchten Beispiele lieferte diese Parallelbindung keine korrekten Hinweise. Weiterhin kann die Erkennung von Fragmenten in der NMR-Methode aus einem Fragment-„Cocktail“ auch davon abhängen, wie der „Cocktail“ zusammengesetzt war.
There are several biophysical methods developed to rapidly identify weakly binding fragments to a target protein. X-ray crystallography provides structural information that is crucial for fragment optimization, however there are several criteria that must be met for a successful fragment screening including the production of soakable and well-diffracting crystals. Therefore, having a reliable cascade of screening methods to be used as pre-screens prior to labor-intensive X-ray crystallography would be extremely beneficial. This would allow the filtering of compounds as the screening progresses so that only the most promising hits remain. But which method should be the one to start the screening cascade? In this work, various sets of fragment libraries were screened against three different proteins; namely tRNA guanine transglycosylase (TGT) an important protein in Shigella, membrane associated protein peroxin 14 (PEX14) of T. Brucei, and endothiapepsin (EP), to investigate whether different screening methods will reveal similar collections of putative binders. The detailed comparative analysis of the findings obtained by the different methods is discussed in this thesis. Shigellosis, an acute bacterial infection of the intestine, is caused by the gram-negative Shigella bacterium whose pathogenicity is reliant on virulence factors (VirF) required to invade epithelial cells. The expression of these VirF is modulated by TGT. Strategies developed to inhibit TGT include potent active-site inhibitors to block the binding of tRNA, thereby preventing the transcription of the virulence factors. Our 96-fragment library was screened against TGT using SPR, NMR, and X-ray crystallography, as described in Chapter 2. A total of 81 fragments were screened in SPR using a direct binding assay approach, revealing a hit rate of 12%. A total of 77 fragments were screened in NMR revealing a hit rate of 29%. High-resolution crystal structures were also collected for the entire fragment library by soaking, revealing a hit rate of 8%. Upon comparison of all discovered fragment hits no overlaps from all three methods were found. Several factors are responsible for this finding such as exclusion of fragments from individual screens due to technical reasons. In detail, four X-ray hits were excluded from the SPR and NMR screens, two SPR hits were discarded from the NMR screen, and five NMR hits were never subjected to the SPR screen. SPR and NMR are currently the most commonly applied primary fragment screening techniques, however, our results suggest that if they would have been applied as incipient methods of a screening cascade, they would have missed three binders discovered by a subsequently applied, more elaborate crystallographic screen. X-ray crystallography allows the detection of specific binders that may be too weak binders to be detected by SPR and even by NMR but can still provide valid structural information to support the search for appropriate starting points in lead discovery. Additionally, MD simulations of the apo wild type TGT have predicted the opening of a transient sub-pocket located above the guanine/preQ1 pocket, which suggested a strategy to target this new binding site for the design of new inhibitors against TGT following a structure- based drug design concept which is also discussed in section 2.3. The human African trypanosomiasis (HAT), also known as the sleeping sickness, is a vector-borne parasitic disease caused by T. brucei and transmitted to humans by bites of the tsetse fly. T. brucei lacks feedback allosteric regulation of early steps in glycolysis but compartmentalizes the relevant enzymes within organelles called glycosomes. PEX14, a peroxin protein essential for biogenesis of glycosomes, forms an important protein-protein interaction with PEX5, an import receptor that transports cytoplasmic glycosomal enzymes into the organelle. Disrupting the PEX14/PEX5 interaction leads to the accumulation of glycosomal enzymes in the cytosol, depletion of ATP, glucose toxicity, metabolic collapse and death of T. brucei. This disruption can be achieved through small molecules that bind to and block PEX14, preventing PEX5 binding. A previous NMR screening of a fragment library resulted in fragment hits that bind to the N-terminal domain (NTD) of T. brucei PEX14. In this project, we attempted to validate these hits through X-ray crystallography by soaking, to allow visualization of the fragment interactions. The promising fragment hits would then be optimized into more potent lead compounds. Crystallization of the NTD PEX14 with a mutation in the first residue (E1W) revealed blocked binding pockets, as described in Chapter 3. The purpose of the added tryptophan was to render fluorescent properties to the short NTD construct which lacked fluorescent amino acids. However, this tryptophan was found to block the binding pockets of its neighboring crystal mates in the protein crystal, rendering a crystal form impossible to use for soaking. Attempts to find new crystal forms with free pockets were unsuccessful, as the small size of the protein and the hydrophobic nature of tryptophan rendered tightly packed protein crystals that block the binding pockets of neighboring crystal mates. Virtual Screening to discover novel ligands for co-crystallization revealed a ligand that aids the crystallization of the E1W PEX14 variant in the same space group but with a slightly different packing. This produced a crystal form that proved successful for fragment soaking as it enabled the binding of two additional fragment hits binding to further protein pockets. Additionally, the wild type form of PEX14 which lacks the tryptophan residue and thus has free binding pockets was crystallized. This enabled the soaking of a previously designed lead compound in different pockets of the PEX5 binding site. By obtaining a crystal structure of this complex at a resolution of 1.8 Å, the feasibility of using wild type PEX14 crystals for further fragment screening has been demonstrated. Endothiapepsin is a member of the pepsin-like aspartic proteases responsible for the hydrolytic cleavage of peptide substrates. Owing to its high degree of similarity to other pharmacologically relevant aspartic proteases, it has served as the model enzyme for studying their mechanism and to discover first lead structures. In previous work done by other members from our group to identify and characterize endothiapepsin binders, X-ray crystallography was consulted as a primary fragment screening method and its hit identification potential was compared to several biochemical and biophysical screening methods. The fragment library screened was designed for general purposes and contained 361 entries. Comparison of the overlap in the hit rates of the different methods to that of X-ray crystallography revealed a low overlap, with the RDA having the highest overlap at 7% and MS having the lowest overlap at 1% followed by STD NMR at 3%. To understand the reason behind the low overlap, two of these screening techniques were prioritized for closer analysis as described in Chapter 4. The 71 X-ray detected fragment hits were selected and rescreened again with STD NMR under slightly different buffer conditions, in addition to WaterLOGSY NMR experiments. The second STD NMR screen detected almost double the amount of hits as the initial one, and the Water LOGSY screen had the highest correlation from the NMR methods to the X-ray hits at 69%. This comparative analysis also revealed the phenomena of active site fragment displacement by use of so-called reporter ligands and that non-deuterated water in STD NMR may lead to false negatives. The entire 361 fragment library was also screened with SPR using an inhibition in solution assay, adding another biophysical method for our comparative analysis to give us further insight of which conditions are crucial to maintain while transferring across different techniques. The resulting hit rate from SPR was 34%, correlating to an overlap of 11% with the X-ray hits - the highest correlation between screening methods reported by us thus far. Finally, we also studied fragment detection and cocktailing in crystallography in comparison to fragment cocktailing in NMR. From this we concluded that cocktailing in crystallography can also lead to false negatives due to fragment competitive behavior and can reveal a different binding mode for a given fragment compared to the adopted geometry found when soaked individually. As for NMR, despite the ability to detect competitive binding of fragments due to the temporary binding and unbinding events, the parallel binding and thus detection of fragments is not always guaranteed as seen in 20% of the fragments we screened, in addition to our observation that the detection of fragments in cocktail NMR may also depend on the comparison of the cocktail set they are a part of.
Databáze: OpenAIRE
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