Functional study of MICU1 and MICU2 proteins in calcium signaling of 'Trypanosoma cruzi'

Autor: Mayara Santos Bertolini
Přispěvatelé: Vercesi, Anibal Eugenio, 1946, Siervo, Miguel Angel Chiurillo, Silber, Ariel Mariano, Silveira, Leonardo dos Reis, Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Miguel Angel Chiurillo Siervo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, uma patologia que afeta milhares de pessoas e ainda não possui tratamento eficaz na fase crônica. A sinalização por cálcio no T. cruzi é importante, entre outras funções, para a invasão da célula hospedeira, diferenciação, osmorregulação, morte celular e função flagelar. O influxo de cálcio na mitocôndria, o qual é importante para homeostase do cálcio intracelular, ocorre através de um complexo uniporter de cálcio mitocondrial (MCUC) que é formado por diversos componentes, incluindo duas proteínas regulatórias da captação de cálcio mitocondrial (MICU1 e MICU2). Nos mamíferos essas proteínas estão localizadas no espaço intermembranas da mitocôndria e são sensíveis à concentração de cálcio citosólico, regulando a abertura do MCU. Embora vários componentes do MCUC tenham sido identificados em tripanossomatídeos, o mecanismo pelo qual ele é regulado ainda é desconhecido. Neste trabalho nós estudamos a função das proteínas MICU1 e MICU2 na captação de cálcio mitocondrial no T. cruzi. A predição das estruturas proteicas de TcMICU1 e TcMICU2 mostraram que há a presença de um domínio de sinal de endereçamento mitocondrial e domínios EF-hands, que seriam sensíveis à concentração de cálcio citosólico. Nós obtivemos linhagens celulares nocaute para TcMICU1 (MICU1-KO) e TcMICU2 (MICU2-KO) utilizando o sistema CRISPR/Cas9 co-transfectando epimastigotas de T. cruzi com o vetor Cas9/pTREX-n (contendo um RNA-guia) e um cassete linear de DNA com um gene de resistência a blasticidina para induzir o reparo da quebra das duas fitas de DNA por recombinação homóloga. Além disso, também geramos uma linhagem celular de epimastigotas de T. cruzi que superexpressam TcMICU2 marcadas com 2xHA (MICU2-OE) utilizando o vetor pTREX-n. Tais construções moleculares foram utilizadas para analisar o fenótipo dos mutantes e indicar quais as funções dessas proteínas. Nossos resultados mostram que MICU1-KO e MICU2-KO apresentam uma diminuição significativa na capacidade em captar cálcio pela mitocôndria, mostrando uma regulação diferente quando comparadas com o que já foi descrito anteriormente em mamíferos. Na ausência dessas proteínas há diminuição da taxa de crescimento e nas taxas de respiração dos epimastigotas, mostrando o quão elas são importantes para esse estágio de T. cruzi. Ademais, os epimastigotas MICU1-KO são capazes de se diferenciarem em tripomastigotas metacíclicos em maior proporção do que as células controle enquanto que a metaciclogênese in vitro foi diminuída nas células MICU2-KO. Usando a linhagem MICU2-OE, por sua vez, demonstramos a localização mitocondrial de TcMICU2 através de microscopia de fluorescência e a superexpressão dessa proteína não altera a capacidade em captar cálcio, assim como não afeta o potencial de membrana mitocondrial e o crescimento dos parasitas. Dessa forma, podemos concluir que as proteínas TcMICU1 e TcMICU2 são essenciais para a regulação da captação de cálcio pelo MCU em T. cruzi. Da mesma forma, os resultados sugerem que ambas as proteínas têm um papel importante no crescimento e diferenciação de epimastigotas Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, a disorder affecting thousands of people, for which an effective treatment is not available for the chronic phase. Calcium signaling is important for host cell invasion, differentiation, osmoregulation, cell death and flagellar function in trypanosomatids. The influx of calcium into the mitochondria, which is important for intracellular calcium homeostasis, occurs through a mitochondrial calcium uniporter complex (MCUC) and this complex consists of several components, including two regulatory proteins named mitochondrial calcium uptake 1 and 2 (MICU1 and MICU2). In mammalian cells, these proteins are located in the mitochondrial intermembrane space and play a role in sensing cytosolic calcium levels and regulating the MCU opening. Although several MCUC components have been identified in trypanosomes, the mechanism by which it is regulated is still unknown. In this work, we aimed at studying the role of MICU1 and MICU2 in the mitochondrial calcium uptake of T. cruzi. The predicted TcMICU1 and TcMICU2 proteins displayed a mitochondrial targeting signal and EF-hands domains that could be sensitive to changes in cytosolic calcium. We obtained TcMICU1 (MICU1-KO) and TcMICU2 (MICU2-KO) knockout cell lines using the CRISPR/Cas9 system by co-transfecting T. cruzi epimastigotes with the Cas9/pTREX-n vector (containing a specific sgRNA) and a DNA donor cassette with a blasticidin resistance marker to induce the DNA double-strand break repair by homologous recombination. Additionally, we generated a cell line of T. cruzi epimastigotes overexpressing TcMICU2 tagged with 2xHA (MICU2-OE) using pTREX-n vector. Such molecular constructs were used to analyze the mutant phenotypes and indicate the functions of these proteins. Our results show that MICU1-KO and MICU2-KO have a significant decrease in the capacity to take up calcium, showing a different regulation when we compared to what has already been described previously in mammals. In the absence of these proteins there is a decrease in the growth rate and respiration rates of epimastigotes, showing how important these two proteins are to this stage of T. cruzi. In addition, MICU1-KO epimastigotes are able to differentiate to metacyclic trypomastigotes in a greater proportion than the control cells while the metacyclogenesis capacity was reduced in MICU2-KO cells. Using the MICU2-OE cell line we demonstrated by immunofluorescence microscopy the mitochondrial localization of MICU2 and that its overexpression does not alter the capacity to take up calcium, besides that it does not affect the mitochondrial membrane potential and parasite growth. We can conclude that the TcMICU1 and TcMICU2 proteins are essential for the regulation of mitochondrial calcium uptake by MCU in T. cruzi. Likewise, the results suggest that both proteins play an important role in the growth and differentiation of epimastigotes Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências FAPESP 2015/25709-8 CAPES
Databáze: OpenAIRE
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