Molekulare Untersuchung des Einflusses der Proteinkinase C auf die osteogene Differenzierung von dentalen Follikelzellen

Autor: Pieles, Oliver Peter
Rok vydání: 2023
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DOI: 10.5283/epub.54118
Popis: Dentale Follikelzellen (DFCs, engl. Dental follicle cells) sind die endogenen Stamm-/Vorläuferzellen des Zahnhalteapparats und können in alveoläre Osteoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten des parodontalen Ligaments differenzieren. DFCs besitzen großes Potential für regenerative Therapien von (dentalem) Knochengewebe, wobei zunächst eine genaue Kenntnis der molekularen Mechanismen während der osteogenen Differenzierung, welche sich in vitro durch BMP2 (engl. Bone morphogenetic protein 2) oder Dexamethason induzieren lässt, erforderlich ist. Nachdem Vorarbeiten zeigten, dass klassische Isoformen der Proteinkinase C (PKC) während der Osteogenese von DFCs herunterreguliert werden und diese hemmen, sollten in der vorliegenden Arbeit die zugrundeliegenden Mechanismen evaluiert werden. Hierfür wurde die Regulierung potentieller Zielproteine und Signalwege nach osteogener Induktion und Hemmung klassischer PKCs untersucht sowie deren Einfluss auf osteogene Marker evaluiert. Dabei wurde festgestellt, dass klassische PKCs die Kinase Akt regulieren und stromabwärts durch Phosphorylierung von GSK3β (Glykogensynthase-Kinase 3β) die Aktivität des Proteins β-Catenin beeinflussen, welches eine wichtige Rolle für die Induktion der Osteogenese spielt. Während Akt zwar die Expression von aktivem β-Catenin unterstützte, führte eine Überaktivierung der Kinase jedoch zur Inhibition der Differenzierung und des Signalwegs stromabwärts von BMP2. Darüber hinaus konnte eine Regulierung des NF-κB (engl. Nuclear factor kappa B)-Signalwegs durch klassische PKCs und Akt nachgewiesen werden, wobei NF-κB die Proliferation und osteogene Differenzierung von DFCs unterdrückte. Dahingegen konnte keine direkte Beteiligung von klassischen PKCs oder Akt an der BMP2-induzierten Aktivierung der Proteinkinase A (PKA), welche die Osteogenese unterstützt, gefunden werden. Stattdessen zeigten die Versuche, dass die PKA-Aktivierung von der intrazellulären Expression des Proteins PTHrP (engl. Parathyroid hormone-related protein) abhängt, und dass PKA den Signalweg stromabwärts von BMP2 durch eine negative Rückkopplung hemmt. Des Weiteren konnte eine Induktion des mitochondrialen Energiemetabolismus und des oxidativen Stresses während der osteogenen Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs festgestellt werden, während eine Hemmung des mitochondrialen Stoffwechsels die Mineralisierung unterdrückte. Eine Evaluierung von Proteinen, welche oxidativen Stress neutralisieren können, zeigte eine Stimulierung der Catalase-Expression und eine Herunterregulierung der Expression von GPX1 (Glutathionperoxidase 1) während der Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs. Überdies führte eine Hemmung der Catalase zu einer verringerten Mineralisierung. Stromaufwärts von PKC wurde PTHrP für die Aktivität der Kinase benötigt, während das Protein WNT5A (engl. Wnt family member 5A) diese unterdrückte. Die Ergebnisse legten dar, dass klassische Isoformen von PKC die osteogene Differenzierung von DFCs über verschiedene Mechanismen hemmen, wobei insbesondere biologische Prozesse reguliert werden, die in späteren Differenzierungsphasen wichtig sind.
Dental follicle cells (DFCs) are the genuine stem/precursor cells of the periodontium and capable of differentiating into alveolar osteoblasts, cementoblasts and periodontal ligament fibroblasts. DFCs possess great potential for regenerative therapies of (dental) bone tissue, but their usage first requires a profound knowledge of the molecular mechanisms during the osteogenic differentiation, which can be induced in vitro by BMP2 (Bone morphogenetic protein 2) or dexamethasone. After previous experiments showed that classical isoforms of PKC (Protein kinase C) are downregulated during osteogenesis of DFCs and inhibit the differentiation, this thesis aimed to evaluate the underlying mechanisms. For this, regulation of potential target proteins and signaling pathways was analyzed after osteogenic induction and inhibition of classical PKCs, and their impact on osteogenic markers was investigated. The results showed that classical PKCs regulate the kinase Akt, which in turn phosphorylates GSK3β (Glycogen synthase kinase 3β) and consequently affects the stability of β-catenin, which plays an important role for the induction of osteogenesis. While Akt supported the expression of active β-catenin, overactivation of the kinase, however, inhibited the differentiation and the signaling pathway downstream of BMP2. Furthermore, classical PKCs and Akt regulated the NF-κB (Nuclear factor kappa B) signaling pathway, and NF-κB was shown to suppress proliferation and osteogenic differentiation of DFCs. By contrast, classical PKCs and Akt were not directly involved in the BMP2-induced activation of protein kinase A (PKA), which is known to support osteogenesis. Instead, the experiments showed that activation of PKA depends on the intracellular expression of the protein PTHrP (Parathyroid hormone-related protein) and that PKA inhibits the signaling pathway downstream of BMP2 via negative feedback. Moreover, mitochondrial energy metabolism and oxidative stress were induced during the osteogenic differentiation as well as after inhibition of classical PKCs, and inhibition of the mitochondrial metabolism suppressed mineralization. Evaluation of proteins which are capable of neutralizing oxidative stress revealed that expression of catalase was upregulated and expression of GPX1 (Glutathione peroxidase 1) was inhibited during differentiation and after inhibition of classical PKCs. Besides, inhibition of catalase attenuated mineralization. Upstream of PKC, PTHrP was required for kinase activity, while WNT5A (Wnt family member 5A) suppressed it. The results showed that classical isoforms of PKC inhibit the osteogenic differentiation of DFCs via different mechanisms, which especially involve biological processes important for later differentiation periods.
Databáze: OpenAIRE
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