Altes Target, Neue Hits - Entwicklung von Inhibitoren für die PIM1-Kinase

Autor: Heyder, Lukas
Přispěvatelé: Diederich, Wibke (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2021
Předmět:
Popis: Within this work, new compounds for inhibiting the PIM1 kinase were synthesized and investigated in three projects based on different preliminary work. The elucidation of the binding modes of promising candidates using protein crystallography allowed for the directed further development of the corresponding molecular structures using methods of rational drug design. The aim was to identify novel binding motifs in order to make them accessible for hit-to-lead optimization and thus provide starting points for the development of clinically useful PIM1 inhibitors. In the first project, structural proposals from a virtual screening approach were to be synthesized for which, despite intensive studies, no synthesis route could yet be established. After a renewed retrosynthetic analysis, a modification of the key reaction enabled the synthesis of at least two of the target compounds. Of these, compound 2.26 showed moderate activity (IC50 = 228 ��M) against the target enzyme, but at the same time exhibited a very well-defined binding mode in the crystal structure and was therefore selected for subsequent optimization. Accordingly, proposals for improving the structure were developed and implemented, taking into account the observed binding position. This included comparative analyses of already published inhibitors as well as considerations on the context of structure-based drug design. Unfortunately, no substantial increase in affinity could yet be achieved, but the gained insights into the binding properties of the structural motif will support the future development of high-affinity derivatives. The protein crystal structure of quinoxaline fragment 3.2 was chosen as the starting point for the second project. Using in silico methods, a number of derivatives were generated from this fragment and investigated via docking. After manual evaluation of the binding mode, promising specimen were synthesized and their biological activity tested. However, these compounds showed no appreciable activity against the PIM1 kinase, casting doubt on the validity of the binding mode from the initial fragment crystal structure. Re-examination of the fragment by X-ray crystallography revealed an alternative binding mode, which had not been considered for generating and evaluating the docking results. In order to circumvent the presumed impairment of the docking hypotheses by the inconsistent binding mode of the fragment, a systematic development via SAR was pursued instead. This process identified compound 3.37 with an IC50 of 89 ��M as a promising candidate for further optimization. In the third project, fragment-based structure proposals from a virtual screening were examined for their synthetic feasibility and a series of target compounds and corresponding analogues were synthesized. Compound 4.70 with an IC50 of 26.4 ��M was identified as a suitable starting point for further optimization. Based on the crystal structure of 4.70 in complex with PIM1, various structural classes were derived that were intended to combine the relevant structural features with easier synthetic accessibility. These included the group of stilbenes (4.77) and indolin-2-on 4.131. For the stilbenes, an IC50 between 1.60 ��M and 4.32 ��M was achieved depending on the substitution pattern. Furthermore, different binding modes could be determined for cis- and trans-isomers on the basis of the respective protein crystal structures, although the cis-isomers exhibited an unstable configuration. In order to simplify the synthesis, cyanostilbene 4.95 was derived from this substance class, which showed an IC50 of 1.72 ��M. Due to the convenient synthetic access, this class of compounds represents an excellent starting point to strive for optimization of the already achieved activity through SAR or computer-assisted modification. Based on the effort to stabilize the cis-stilbenes in their configuration, accordingly substituted five-membered heterocycles were developed. Among those, triazole 4.114 with an IC50 of 4.49 ��M also represents a suitable starting point for the further development of inhibitors. The indolin-2-one-compound 4.131 showed the highest affinity of all compounds investigated in this work with an IC50 of 0.60 ��M. Utilizing a SAR, the significance of individual structural features for the affinity could be determined; in the course of this, positions for the directed further development were also identified. By using the crystal structure of a suitable analogue, it was also possible to determine the binding mode of this substance class, so that computer-assisted methods as well as structure-based drug design can be applied for further optimization. Overall, a number of hits with activity against the PIM1 kinase within the single-digit micromolar range were identified in the course of this work. The development of reliable synthesis routes combined with the systematic analysis of the relevant structural motifs also laid the foundation for subsequent efforts to optimize these compounds into high-affinity inhibitors.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Grundlage unterschiedlicher Vorarbeiten in drei Projekten neue Verbindungen zur Hemmung der PIM1-Kinase synthetisiert und untersucht. Die Betrachtung der Bindungsmodi vielversprechender Kandidaten anhand von Proteinkristallstrukturen erlaubte die gerichtete Weiterentwicklung der entsprechenden Molek��le unter Anwendung von Methoden des rationalen Wirkstoffdesigns. Das Ziel war die Identifizierung neuartiger Bindemotive, um diese f��r die hit-to-lead-Optimierung zug��nglich zu machen und damit Ansatzpunkte f��r die Entwicklung klinisch nutzbarer PIM1-Inhibitoren zu liefern. Im ersten Projekt sollten Strukturvorschl��ge aus einem virtual screening-Ansatz synthetisiert werden, f��r welche trotz intensiver Studien bisher noch keine Syntheseroute etabliert werden konnte. Nach einer erneuten retrosynthetischen Analyse wurde eine Abwandlung der Schl��sselreaktion vorgenommen, sodass schlie��lich zwei der Strukturvorschl��ge dargestellt werden konnten. Davon wies Verbindung 2.26 zwar eine m����ige Aktivit��t (IC50 = 228 ��M) gegen das Zielenzym auf, zeigte jedoch gleichzeitig einen sehr gut definierten Bindungsmodus in der Kristallstruktur und wurde daher f��r die anschlie��ende Optimierung ausgew��hlt. In der Folge wurden unter Ber��cksichtigung der beobachteten Bindeposition Vorschl��ge f��r eine Verbesserung der Struktur erarbeitet und umgesetzt. Dabei flossen sowohl komparative Analysen bereits publizierter Inhibitoren mit ein, als auch ��berlegungen im Rahmen strukturbasierten Wirkstoff��designs. Es konnte bisher noch keine substanzielle Erh��hung der Affinit��t erreicht werden, jedoch wurden neue Erkenntnisse ��ber die Bindungseigenschaften des Strukturmotivs gewonnen, welche die zuk��nftige Entwicklung hochaffiner Derivate unterst��tzen. Als Startpunkt des zweiten Projektes wurde die Proteinkristallstruktur des Quinoxalin-Fragmentes 3.2 gew��hlt. Durch einen Kooperationspartner wurde ausgehend von diesem Fragment mit in silico-Methoden eine Reihe von Derivaten generiert und in das Zielenzym gedockt. Nach einer Bewertung der Bindungs��modi wurden vielversprechende Exemplare synthetisiert und ihre biologische Aktivit��t getestet. Diese Verbindungen wiesen jedoch keine nennenswerte Aktivit��t gegen die PIM1-Kinase auf, was Zweifel an der Validit��t der urspr��nglichen Fragment-Kristallstruktur aufwarf. Die erneute r��ntgenkristallographische Untersuchung des Fragmentes ergab einen zweiten Bindungsmodus, welcher f��r die Generierung und Bewertung der docking-Ergebnisse nicht ber��cksichtigt worden war. Um die vermutete Beeintr��chtigung der docking-Hypothesen durch den inkonsistenten Bindungs-modus des Fragmentes zu umgehen, wurde stattdessen eine systematische Weiterentwicklung im Rahmen ein SAR angestrebt. Dabei konnte Verbindung 3.37 mit einem IC50-Wert von 89 ��M als viel-versprechender Ausgangspunkt f��r die weitere Optimierung identifiziert werden. Im dritten Projekt wurden Fragment-basierte Strukturvorschl��ge aus einem virtual screening auf ihre synthetische Umsetzbarkeit hin untersucht und eine Reihe von Zielverbindungen und entsprechender Analoga synthetisiert. Dabei wurde Verbindung 4.70 mit einem IC50-Wert von 26.4 ��M als geeigneter Startpunkt f��r die weitere Optimierung identifiziert. Auf Grundlage der Kristallstruktur von 4.70 im Komplex mit PIM1 wurden verschiedene Strukturklassen abgeleitet, welche die relevanten Strukturmerkmale mit einer einfacheren synthetischen Darstellbarkeit kombinieren sollten. Dazu geh��rten die Stilbene (4.77) und Indolin-2-on 4.131. Bei den Stilbenen wurde abh��ngig vom Substitutionsmuster ein IC50-Wert zwischen 1.60 ��M und 4.32 ��M erreicht. Zudem konnten f��r cis- und trans-Isomer anhand von Proteinkristall��strukturen unterschiedliche Bindungsmodi festgestellt werden. Zum Zwecke einer weiteren Vereinfachung der Synthese wurde aus dieser Substanzklasse das Cyanostilben 4.95 abgeleitet, welches einen IC50-Wert von 1.72 ��M aufwies. Diese Verbindungsklasse stellt aufgrund ihrer einfachen Synthetisierbarkeit einen exzellenten Ausgangspunkt dar, um durch eine SAR oder computergest��tzte Modifizierung eine Optimierung der bereits erreichten Aktivit��t anzustreben. Ferner wurde ausgehend von der Bestrebung, die cis-Stilbene in ihrer Konformation zu stabilisieren, das substituierte Triazol 4.114 entwickelt, welches mit einem IC50-Wert von 4.49 ��M ebenfalls einen vielversprechenden Ausgangs-punkt f��r die weitere Entwicklung von Inhibitoren darstellt. Im Falle der Indolin-2-one zeigte Verbindung 4.131 mit einem IC50-Wert von 0.60 ��M die st��rkste Affinit��t aller in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen. Mithilfe einer SAR konnte die Bedeutung einzelner Strukturmerkmale f��r die Affinit��t ermittelt werden, im Zuge dessen wurden zudem Positionen f��r die gerichtete Weiterentwicklung identifiziert. Anhand der Kristallstruktur eines Analogons konnte ferner der Bindungsmodus dieser Substanzklasse bestimmt werden, sodass nunmehr auch eine computergest��tzte Optimierung mit den Methoden des Struktur-basierten Wirkstoffdesigns m��glich ist. Insgesamt konnten damit im Rahmen dieser Arbeit eine Reihe von hits mit Aktivit��t gegen die PIM1-Kinase im einstellig mikromolaren Bereich identifiziert werden. Durch die Entwicklung von zuverl��ssigen Syntheserouten verbunden mit der systematischen Analyse der relevanten Strukturmotive wurde zudem die Grundlage f��r nachfolgende Bestrebungen gelegt, diese Verbindungen zu hochaffinen Inhibitoren zu optimieren.
Databáze: OpenAIRE
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