Cryptococcus neoformans’ın lipit damlacıklarının boyanmasında üç farklı BODIPY bileşiğinin akan hücre ölçer için optimizasyonu
| Autor: | Mücahit Seçme, Ergun Mete, Çağrı Ergin, Melek Pamuk Algi |
|---|---|
| Přispěvatelé: | Sabire Yazıcı Fen Edebiyat Fakültesi |
| Jazyk: | turečtina |
| Rok vydání: | 2021 |
| Předmět: |
Microbiology (medical)
Boron Compounds Optimization Cryptococcus Neoformans Flow cytometry chemistry.chemical_compound Optimizasyon BODIPY Lipid droplet medicine Fluorescence microscope Humans Paraformaldehyde Fluorescent Dyes General Immunology and Microbiology medicine.diagnostic_test Staining and Labeling Chemistry Nile red Flow Cytometry Lipid droplets Yeast Staining Infectious Diseases Cytoplasm Biophysics Derivatives Lipit Damlacıkları |
| Popis: | The pathogenic Cryptococcus neoformans causes life-threatening disease in immunocompromised patients. Although there are hypotheses about the role of lipid droplets in C.neoformans pathogenesis, there is still not extensively data determined on the subject yet. Lipid droplets are dynamic cytoplasmic energy storage bodies in yeasts. Diazo dyes, Nile red, LD540 and borradiazaindasen (BODIPY) molecules are frequently used in the lipid droplets studies. BODIPY (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene) dyestuffs are among the brightest green light emitting fluorophores. These neutral molecules have high lipophilicity and can easily pass through the cell wall and membrane. In this study, for the future studies on lipid droplets of C.neoformans, we aimed to optimize three different BODIPY (BODIPY480/525, BODIPY480/530, BODIPY480/535) molecules for fluorescence microscopy and flow cytometry system. Ten molecularly confirmed environmental C.neoformans strains were grown on Sabouraud dextrose agar with and without oleic acid. BODIPY staining protocols at different concentrations were used for C.neoformans lipid droplets fixed with paraformaldehyde. The visualization (by fluorescence microscopy) and detection (by flow cytometer) of the lipid droplet structures of C.neoformans strains were evaluated. Forward-scatter and side-scatter analysis were performed to evaluate the number of lipid droplets determined in the cytoplasmic region quadrant in flow cytometry. The staining of the lipid droplets of C.neoformans of all three BODIPY molecules used in the study was observed by fluorescence microscope with creating distinct brightness and sharp contrast with the background. All BODIPY molecules could be examined by fluorescence microscopy without loss of brightness in more than one minute. The optimal dye concentration of BODIPY compounds were found as 2 µM. Incubation at room temperature for five minutes was sufficient for fluorochrome staining. They were also shown to be able to stain lipid droplets in heat-inactivated C.neoformans strains in all three compounds. The synthesized BODIPY480/525, BODIPY480/530 and BODIPY480/535 molecules were evaluated in accordance with the staining of lipid droplets, which were claimed to play a role in the pathogenesis of C.neoformans, and analysis by fluorescence microscopy and analysis with flow cytometer. BODIPY molecules may exhibit different properties in staining lipid droplets. These molecules should be tested for demonstrating the presence of lipid droplets in different yeast species and their suitability for pathogenesis studies. Patojenik Cryptococcus neoformans immün sistemi baskılanmış hastalarda hayatı tehdit eden enfeksiyonlara neden olmaktadır. C.neoformans patogenezinde lipit damlacıklarının rolü hakkında hipotezler bulunsa da, henüz konu hakkında kapsamlı veri bulunmamaktadır. Lipit damlacıkları, mayalarda bulunan dinamik sitoplazmik enerji depolama cisimleridir. Lipit damlacıklarının araştırılmasında sıklıkla diazo boyalar, Nil kırmızısı, LD540 ve boradiazaindasen (BODIPY) bileşikleri kullanılmaktadır. BODIPY (4,4-difloro4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene) boyar maddeler en parlak yeşil ışık yayan floroforlar arasındadır. Bu nötr bileşikler yüksek lipofilikliğe sahiptir; hücre duvar ve membranından kolaylıkla geçerler. Bu çalışmada, C neoformans’ın lipit damlacıkları ile ilgili gelecekteki çalışmalara yönelik olarak üç farklı BODIPY bileşiğini (BODIPY480/525, BODIPY480/530, BODIPY480/535) floresan mikroskopi ve akan hücre ölçer cihazı için optimize edilmesi amaçlanmıştır. Moleküler tanımlaması yapılmış on farklı çevresel C.neoformans izolatı, oleik asit içeren ve içermeyen Sabouraud dekstroz agar besiyerinde üretilmiştir. Paraformaldehit ile fikse edilen C.neoformans lipit damlacıkları için farklı konsantrasyonlarda BODIPY boyama yöntemleri uygulanmıştır. C.neoformans izolatlarının lipit damlacıkları floresans mikroskopi ile görselleştirilmiş ve akan hücre ölçer ile saptanarak değerlendirilmiştir. Akan hücre ölçerde, sitoplazmik bölge kadranında belirlenen lipit damlacıklarının sayılarını değerlendirmek için ileri-saçılım ve yan-saçılım analizi yapılmıştır. Araştırmada kullanılan her üç BODIPY bileşiğinin, C.neoformans’ın lipit damlacıklarını boyaması floresans mikroskobu ile belirgin parlaklık ve zemin ile keskin kontrast oluşturacak şekilde izlenmiştir. Tüm BODIPY bileşikleri bir dakikayı geçen süre içinde parlaklık kaybı olmaksızın floresan mikroskobu ile incelenebilmiştir. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
|