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Eine Zunahme an Fällen von Clostridioides (C.) difficile Erkrankungen ist weltweit zu sehen. Vor allem hypervirulente Stämme sowie vermehrte Antibiotikaresistenzen durch häufigeren Einsatz an Antibiotika führen zu einer Zunahme. Die Suche nach neuen Therapeutika gegen die Toxine als Hauptvirulenzfaktoren ist deshalb unerlässlich. Bereits anderweitig zugelassene Medikamente und körpereigene Stoffe werden dabei präferiert, da sie Vorteile in der Anwendung und Sicherheit mit sich bringen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das bereits zugelassene Medikament Ambroxol (Ax) einen inhibitorischen Effekt auf die Toxine Toxin A (TcdA), Toxin B (TcdB) und Clostridium difficile Transferase (CDT) von C. difficile hat. In Zytotoxizitätsversuchen wurde die Wirkung von Ax auf die Toxine TcdA, TcdB und CDT untersucht. Dabei wurde der Verlauf der Vergiftung beobachtet und eine Zeitabhängigkeit und Konzentrationsabhängigkeit der Inhibition durch Ax festgestellt. Aufbauend auf den Zellversuchen wurde bei TcdA und TcdB auf molekularer Ebene der Glykosylierungsstatus von Rac1 untersucht. Bei Rac1 handelt es sich um ein Substrat der Glykosyltransferase von TcdA und TcdB und dies wurde genutzt, um auf molekularer Ebene eine Vergiftung durch die Toxine anzuzeigen. Für TcdA wurde ein inhibitorischer Effekt von Ax bei der Analyse des Glykosylierungsstatus von Rac1 in CaCo-2 Zellen nachgewiesen. Ebenso konnte für TcdB ein inhibitorischer Effekt von Ax auf den Glykosylierungsstatus von Rac1 in Vero Zellen gezeigt werden. Eine Hemmung durch Ax wurde ebenfalls für die klinisch relevante Kombination aus TcdA und TcdB in Zytotoxizitätsversuchen gezeigt. Eine Hemmung in Zytotoxizitätsversuchen mit CDT konnte erst bei höheren Konzentrationen von im Vergleich zu TcdA und TcdB gezeigt werden. Eine eindeutige Inhibition durch Ax wurde weder im TEER Assay noch bei Auswertung des ADP-Ribosylierungsstatus von G-Aktin innerhalb der Zellen beobachtetet. Zum besseren Verständnis der Wirkungsweise wurden die einzelnen Komponenten von CDT untersucht. Ein Einfluss von Ax auf die Enzymaktivität der enzymatisch aktiven A-Komponente von CDT (CDTa) wurde nicht festgestellt. Ebenso konnte kein Einfluss von Ax auf die Rezeptorbindung der Bindungs- und Translokationskomponente von CDT (CDTb) gezeigt werden. Jedoch ließ sich ein inhibitorischer Effekt von Ax auf den zytotoxischen Eigeneffekt von CDTb beobachtet. Dieser inhibitorische Effekt trat schon bei deutlich geringeren Konzentrationen als bei TcdA, TcdB oder CDT auf und zeigte sich über einen längeren Zeitraum von >24 h konstant. Außerdem wurde ein Eigeneffekt von Ax auf die verwendeten Zelllinien der Vero und CaCo-2 Zellen beobachtet. Die morphologischen Veränderungen traten innerhalb der ersten beiden Stunden auf und waren bei niedrigeren Konzentrationen von Ax reversibel. Bei höheren Konzentrationen wurden irreversible Auswirkungen auf die Zellviabilität festgestellt. Eine Theorie über die inhibitorische Wirkungsweise von Ax auf TcdA, TcdB und CDT basiert auf einer möglichen Inhibition durch eine pH-Pufferung in den Endosomen, durch die die Ansäuerung des endosomalen Milieus inhibiert wird. Die endosomale Ansäuerung ist ein notwendiger Schritt für die Translokation der enzymatisch aktiven Domänen ins Zytosol. Tatsächlich konnte Ax schon eine Anhebung des pH-Wertes in sauren Ca2+-Speichern in der Lunge auslösen, was auf dem basischen Charakter und einer sekundenschnellen, passiven Diffusion von Ax zurückzuführen war. Eine pH-Pufferung scheint deshalb die wahrscheinlichste Wirkungsweise. Weitere inhibitorische Mechanismen können nicht ausgeschlossen werden, v.a. da sich die Konzentrationsunterschiede bei der Inhibition von TcdA/TcdB und CDT durch eine alleinige pH-Pufferung von Ax nicht erklären ließen. Desweitern scheint eine Interaktion mit der Pore von CDTb denkbar. Ax weist Ähnlichkeiten zu bekannten Porenblockern wie Chloroquin auf und zeigte eine starke Inhibition des zytotoxische Eigeneffekt von CDTb. Es wird vermutet, dass dieser ähnlich wie bei Porenbildenden Toxinen (PFTs) auf einer Porenbildung in der Membran zurückzuführen ist und die Membranintegrität stört. Eine Blockade der CDTb-induzierten Pore ist denkbar. Da die Wirkungsweise von Ax nicht geklärt werden konnte, scheinen weiterer Experimente zur Klärung der Wirkungsweise indiziert. Ob Ax eine inhibitorische Wirkung auf andere bakterielle Toxine hat, könnte zur Ermittlung der Wirkungsweise beitragen und damit das Verständnis für inhibitorische Mechanismen an bakteriellen Toxinen erweitern und bei der Suche nach geeigneten Therapien für C. difficile Erkrankungen hilfreich sein. Weitere Experimente zur Wirkungsweise scheinen deshalb sinnvoll zu sein. |
