Identification, expression and characterization of archaeal-type opsins of Chlamydomonas reinhardtii

Autor: Kateriya, Suneel
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2005
Předmět:
Popis: Phototaxis and photophobic responses of green algae are mediated by rhodopsin-based photoreceptors that use microbial-type chromophores (all-trans retinal). Analysis of stimuli-response curves of the C. reinhardtii photoreceptor current led to the suggestion that they are based on two photosystems, one of which is more active at low flash intensities, whereas the other dominates at high flash energies. Two cDNA sequences were identified in the EST database of the C.reinhardtii that encoded microbial-type opsins, which were named Chlamyopsin-3 and 4 (Cop-3 and Cop-4) respectively, based on their homology to the known microbial-type opsins. The seven-transmembrane helices at the N-terminus of these opsins showed homology to the light-activated proton pump, bacteriorhodopsin (BR). However, after functional expression in the oocytes of X. laevis these opsins were renamed as Channelopsin-1 and 2 (Chop-1 and Chop-2) based on their ion channel activity. The amino acids that form the H+-conducting network in BR are conserved in Chop-1 and Chop-2, whereas the rest of their sequences are different. Heterologoulsy expressed Channelopsins (Chop-1 and 2) in E.coli formed inclusion bodies, and thus recombinant proteins were not functional. Expression of Chop-1 in P. pastoris led to the production of non-functional protein, since it did not bind all-trans retinal. Functional expression of Chop-1 mRNA in the oocytes of X. laevis (Chop-1 + all-trans retinal =ChR1) showed a light-gated ion channel conductance, which was studied in detail using a two-electrode voltage clamp technique (Nagel et al., 2002). The observed transport activity was purely passive and directly dependent on the membrane potential and the proton concentration gradient in bath solution. Outward photocurrents could be observed at high exracellular pH or low intracellular pH. The conductance was highly selective for protons, and other monovalent or divalent ions were not found to be permeating. It was also observed by mutational analysis that the H173 residue of Chop-1 does not function as a proton donor of a deprotonated Schiff base. Therefore, it was suggested that in ChR1 the retinal Schiff base is not de-protonated during the photocycle. It is likely that such light sensitive ion channels are widely distributed in other phototactic microalgae, as well as in gametes and zoospores of the macroalgae. This claim is corroborated by the observation that Volvoxopsin-2 (Vop-2) a partial opsin like sequence was identified in the V. carteri genome project, which showed 75% identical amino acid residues to Channelopsins in the helices 5-7 of the opsin domain. Heterologous expression of Chop-2 was also carried out in E.coli to produce functional recombinant protein. It was observed that the expression characteristic of Chop-2 were similar to that of Chop-1. Therefore, Chop-2 was directly expressed in Xenopus oocytes, in the presence of all-trans retinal to produce functional Channelrhodopsin-2 (ChR2) (Nagel et al., 2003). Photocurrents were recorded from these oocytes using two-electrode voltage clamp method. However, the cells not only became conductive for protons but also, most surprisingly, for monvalent and divalent cations like Na+ K+ and Ca++. It was concluded that ChR-2 functions as a cation-selective channel. Surprisingly, and in contrast to ChR1, the light-gated conductance of ChR-2 inactivates in continuous light to a smaller steady-state level. Western blotting analysis with membrane fractions of C. reinhardtii using anti-Chop1 and Chop2 antibodies revealed that both proteins were abundant, when cells were grown in low light conditions, both are degraded under high light conditions and that ChR2 was degraded more rapidly than ChR1. In conclusion, it is likely that both channelrhodopsins control photophobic responses and only indirectly influence phototaxis. Very recently, three more protein sequences were found in C. reinhardtii genome database, which showed homology to the sensory opsin. Surprisingly, all three sequences were coupled to a transducer like protein (HtrI and II). We have provisionally named these sequences Cop5, Cop6 and Cop7. Isolation, sequencing and bioinformatic analysis of Cop-5 protein sequence revealed that it is a unique putative opsin, which has four modular domains (Opsin, HK, RR and CYCc) in one protein. The assumption that one of these new rhodopsins could be responsible for phototaxis movement in C. reinhardtii seems to be justified. Nevertheless, other functions like control of retinal biosynthesis or developmental processes should also be taken into account.
In Grünalgen werden sowohl phototaktische als auch photophobische Reaktionen durch Photorezeptoren vermittelt, die � auf Rhodopsin basierend � als Chromophore all-trans-Retinal tragen und somit dem sogenannten mikrobiellen Typus zugeordnet werden. Eine Analyse der Reiz-Antwort-Kurven des Photorezeptorstroms der Alge Chlamydomonas reinhardtii führte zu der Vermutung, dass diese durch zwei Photorezeptorsysteme hervorgerufen werden, von denen das eine vor allem bei niedrigen Lichtblitzintensitäten aktiv ist, das andere dagegen bei hohen Lichtenergien bestimmend ist. In der EST-Datenbank von C. reinhardtii konnten zwei cDNA-Sequenzen identifiziert werden, die für Opsine des mikrobiellen Typs kodieren und aufgrund dieser Homologie als Chlamyopsin-3 bzw. -4 (Cop-3 und Cop-4) bezeichnet werden. Eine Dömane mit sieben Transmembranhelices am N-Terminus beider Opsine zeigt zudem eine Homologie zu einer lichtgetriebenen Protonenpumpe, dem Bakteriorhodopsin (BR). Dabei sind diejenigen Aminosäurereste, die im BR ein Netzwerk zur Weiterleitung der Protonen bilden, in beiden Proteinen konserviert. Bei der Expression in Xenopus laevis-Oocyten zeigten die Genprodukte der beiden Gene die Aktivität von Ionenkanälen und wurden deshalb in Channelopsin-1 und -2 (Chop-1 und Chop-2) umbenannt. Eine heterologe Expression der Channelopsine Chop-1 und -2 in E.coli resultierte in der Bildung von unlöslichen "inclusion bodies", so dass die rekombinanten Proteine nicht funktionell waren. Ebenso führte die Expression von Chop-1 in Pichia pastoris zu einem nicht funktionellen Produkt, da das rekombinante Protein kein all-trans-Retinal binden konnte. Dagegen ergab die Translation von Chop-1-mRNA in Xenopus laevis-Oocyten eine durch Licht hervorgerufene Leitfähigkeit eines Ionenkanal, die im Detail mit Hilfe der Zwei-Elektroden-"voltage clamp"-Technik weiter untersucht wurde (Nagel et al., 2002). Bei der beobachteten Leitfähigkeit handelte es sich um einen rein passiven Transport, der direkt vom Membranpotential und von der Protonenkonzentration im Medium abhängig ist. Auswärts gerichtete Photoströme zeigten sich bei hohen extrazellulären oder niedrigen intrazellulären pH-Werten. Die Leitfähigkeit beschränkte sich dabei ausschließlich auf Protonen, andere mono- oder divalente Ionen waren nicht permeabel. Durch Mutationsanalyse konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest an Position 173 des Chop-1 dabei nicht als Protonendonor für eine deprotonierte Schiffsche Base fungiert, was darauf schließen lässt, dass im ChR1 (Chop-1 mit seinem Chromophor all-trans-Retinal) die Schiffsche Base des Retinals während des Lichtzyklus nicht deprotoniert wird. Sehr wahrscheinlich ist das Auftreten solcher licht-sensitiven Ionenkanäle in anderen phototaktischen Mikroalgen � ebenso wie in Gameten und Zoosporen von Makroalgen � weit verbreitet. Unterstützt wir diese Behauptung durch die Identifizierung einer dem Opsin teilweise ähnlichen Gensequenz im Rahmen des Genomprojekts von Volvox carteri, dem sogenannten Volvoxopsin-2 (Vop-2), das verglichen mit den Channelopsinen 75% identische Aminosäurereste in den Transmembranhelices 5-7 der Opsindomäne aufweist. Eine funktionelle Expression von Chop-2 war wiederum in Xenopus laevis-Oocyten in Anwesenheit von all-trans-Retinal möglich (Nagel et al., 2003). Ebenso konnten mit der Zwei-Elektroden-"voltage clamp"-Methode lichtinduzierte Ströme gemessen werden, die diesmal aber nicht nur auf die Leitfähigkeit der Zellen für Protonen, sondern überraschenderweise auch für andere mono- und divalente Ionen wie Na+, K+ und Ca++ zurückzuführen waren, was für ChR-2 auf eine Funktion als selektiver Kationenkanal hindeutet. Darüberhinaus klingt im Vergleich zu ChR-1 die durch Licht induzierte Leitfähigkeit von ChR-2 bei Dauerlicht auf einen kleineren steady-state-Wert ab. Eine Western-Blot-Analyse von Membranfraktionen von C. reinhardtii mit anti-Chop-1- und anti-Chop-2-Antikörpern zeigte ein vermehrtes Auftreten beider Proteine unter Schwachlicht- Bedingungen und einen Abbau unter Starklicht, wobei ChR-2 schneller abgebaut wurde. Letztendlich lässt sich für beide Channelrhodopsine wahrscheinlich auf eine Rolle bei der photophobischen Reaktion schließen, ihr Einfluss auf die Phototaxis ist eher indirekt. Vor kurzem wurden in der C. reinhardtii Genom-Datenbank drei weitere Sequenzen gefunden, deren Genprodukte eine Homologie zum sensorischen Opsin aufweisen und vorläufig als Cop-5, Cop-6 und Cop-7 bezeichnet wurden. Überraschend ist dabei, dass alle drei Sequenzen zudem für eine "Transducer"-ähnliche Proteindomäne kodieren (HtrI und II). Die Isolierung und Analyse der kodierenden Sequenz von Cop-5 zeigte, dass es sich um ein neuartiges Opsin mit einer modularen Struktur aus vier Domänen (Opsin, HK, RR und CYCc) handelt. Eines dieser neuen Rhodopsine könnte für die phototaktischen Bewegung von C. rheinhardtii verantwortlich sein. Trotzdem sind auch andere Funktionen wie in der Biosynthese des Retinals oder während der Algenentwicklung denkbar.
Databáze: OpenAIRE
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