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Durante il corso di Dottorato in Scienza del Farmaco, svolto in gran parte presso il Centro di Biotecnologie dell’A.O.R.N. “A. Cardarelli”, l’attività di ricerca si è focalizzata sulla valutazione delle potenzialità del mini Bioartificial Liver (miniBAL) come biosensore a cellule epatiche per la determinazione dell’epatotossicità di molecole che abbiano effetto diretto sulla capacità sintetico e/o metabolica della cellula epatica e per lo studio delle reazioni di biotrasformazione epatica citocromo P450-dipendenti. La valutazione della epatotossicità di prodotti farmaceutici, cosmetici e alimentari rappresenta, infatti, un passo obbligato per l’immissione in commercio di nuovi prodotti, soprattutto in ambito farmaceutico. Pertanto è divenuta ormai pressante la domanda di sistemi ‘low cost’ per valutazioni di epatotossicità, da utilizzare per screening in vitro su modelli vicini a quello umano, in una fase quanto più precoce del processo di sviluppo dei farmaci. Presso il Centro di Biotecnologie è stato messo a punto il “miniBAL”, in collaborazione con l’Academic Medical Center di Amsterdam, che è capace di contenere 300 milioni di epatociti umani vitali con una vitalità ≥ 85%, provenienti da resezioni epatiche o da fegati ritenuti non idonei per il trapianto d’organo. Il miniBAL è costituito da una struttura tridimensionale che permette di realizzare le migliori condizioni per l’annidamento degli epatociti; inoltre a differenza dei sistemi in monostrato, presenta un sistema di ossigenazione integrato per l’ottimizzazione delle funzioni metaboliche e respiratorie. Una fase preliminare del progetto è stata dedicata alla messa a punto delle procedure operative, alla definizione dei protocolli tossicologici e alla ottimizzazione della biomassa cellulare capace di assicurare una omogenea distribuzione cellulare all’interno del device. Successivamente, su commessa di una multinazionale europea, il miniBAL caricato con epatociti umani è stato impiegato per la valutazione dell’epatotossicità di anticorpo monoclonale coniugato ad una tossina (BT062) e della tossina da sola (DM-4) allo scopo di investigare gli effetti tossici in particolare a livello epatico prima che queste molecole siano messe in commercio per il trattamento del mieloma multiplo recidivante remittente. Questa immunotossina appartiene ad una nuova classe di molecole che hanno la capacità di interagire con un dato bersaglio molecolare (l’antigene CD138 overespresso sulla superficie delle plasmacellule tumorali, ma anche sugli epatociti) e riversare su di esse in maniera specifica l’azione della tossina legata (Tumor Activated Prodrug Technology). Differenti concentrazioni di questa immunotossina sono state incubate nel miniBAL caricato con 300 milioni di epatociti umani vitali per 6 ore; si è poi proceduto alla valutazione funzionale degli indici di funzione epatocitaria (sintesi di urea, consumo di ammonio) ed alla determinazione della vitalità e della proliferazione cellulari a livello mitocondriale fino a 72 ore post incubazione dell’epatotossico. E’stata eseguita anche un’indagine immunoistochimica dei principali parametri morfologici e funzionali. I risultati finora conseguiti indicano che il miniBAL si configura come efficace strumento per la valutazione dell’epatotossicità di nuovi farmaci e/o molecole, permettendo di ricavare informazioni sulla tossicità relazionate non solo alla funzione d’organo, ma anche alla specificità di specie. Lo sviluppo del miniBAL caricato con epatociti umani ed i vantaggi legati al processo di standardizzazione di questo sistema rappresentano uno strumento di primaria importanza per lo studio e la valutazione farmacologica e tossicologica di farmaci dalla potenziale applicazione clinica nell’uomo. Lo sviluppo di questo dispositivo potrà, inoltre, consentire una riduzione significativa dell’uso degli animali utilizzati nella determinazione della tossicità epatica, nel rispetto etico della sperimentazione. L’attività di dottorato ha, inoltre, riguardato la messa a punto di una banca di epatociti umani, che consente di avere cellule da scongelare on demand da mettere a disposizione per il miniBAL ed anche per gruppi di ricerca e multinazionali che potranno richiederli per studi di tossicità e/o di metabolismo, virologici, induzione/inibizione enzimatica. Il perfezionamento della tecnica di isolamento degli epatociti da resezioni chirurgiche e da fegati scartati per il trapianto d’organo, ha, infatti, reso possibile l’ottenimento di un elevato numero di cellule eccedenti rispetto a quelle necessarie per la procedura. La criopreservazione in azoto liquido degli epatociti rappresenta, quindi, l’unica possibilità di utilizzarli nel lungo termine. |
