Analysis of the subcellular localization of N-acetylaspartic acid synthesis and its effects on cancer cell metabolism

Autor: Ludwig, Tobias
Přispěvatelé: Hiller, Karsten, Jahn, Dieter
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2023
Předmět:
DOI: 10.24355/dbbs.084-202302091644-0
Popis: N-acetylaspartic acid (NAA) is the second most abundant metabolite in the human brain. It is synthesized from aspartate and acetyl-CoA by the enzyme N-acetylaspartate synthetase (NAT8L). In the brain, NAA is synthesized in neurons with subsequent transport to oligodendrocytes, where it is cleaved by aspartoacylase to aspartate and acetate. Recently, several independent research groups have shown that NAA and its biosynthetic enzyme NAT8L are also present in several cancer types, brown adipocytes, and cells of the immune system. However, the functional role of NAA in the brain, as well as in peripheral tissue, is poorly understood. One of the reasons for the lack of a functional understanding of NAA metabolism is that the subcellular localization of NAA synthesis is controversial and several conflicting studies have been published in the past. In this thesis, I present an enzyme activity assay linking NAA synthesis in cancer cells and primary neurons directly to the cytosol and not to the mitochondria. I demonstrate the metabolic activity of NAT8L by the in vitro synthesis of [1-413C4]NAA from [U-13C4]aspartate by GC-MS. Further, I show cytosolic localization of NAA synthesis by siRNA-mediated gene knockdowns. When silencing genes necessary to maintain mitochondrial acetyl-CoA levels, I detect no changes in NAA levels. If NAA would be produced in the mitochondria, the levels should decrease, as acetyl-CoA is one of the precursors for NAA synthesis. However, when I silence genes contributing to cytosolic acetyl-CoA levels, NAA levels are significantly reduced. With siRNA-mediated gene knockdowns, I demonstrated that the expression of NAT8L is essential for cancer cells. Cell proliferation was significantly reduced after the knockdown and could not be recovered by external NAA. Although NAA is synthesized in the cytosol, it has a direct effect on mitochondria. Using stable isotope labeling in combination with digitonin-permeabilized cells, I show that NAA increases mitochondrial glutamine (but not pyruvate) oxidation and the oxygen consumption rate. Moreover, I show that this effect is not based on the degradation products (aspartate and acetate) but on the complete NAA molecule itself. In agreement with this data, I detected no aspartoacylase expression in cancer cells, suggesting a signaling function of NAA, besides its role as a carbon donor.
N-Acetylasparaginsäure (NAA) ist ein Aminosäurederivat, das in hohen Konzentrationen im menschlichen Gehirn vorkommt. Die Synthese erfolgt aus Acetyl-CoA und der Aminosäure Asparaginsäure durch das Enzym N-Acetylaspartat-Synthetase (NAT8L). NAA wird im Gehirn in Neuronen gebildet und anschließend zu den Oligodendrozyten transportiert. Dort erfolgt der Abbau zu Asparaginsäure und Azetat durch die Aspartoacylase. Kürzlich haben mehrere unabhängige Forschungsgruppen NAA und sein biosynthetisches Enzym NAT8L auch in mehreren Krebsarten, braunen Adipozyten und Immunzellen nachgewiesen. Die funktionelle Rolle von NAA im Gehirn sowie im peripheren Gewebe ist jedoch kaum verstanden. Einer der Gründe für das fehlende funktionelle Verständnis des NAA-Stoffwechsels ist, dass die subzelluläre Lokalisierung der NAA-Synthese umstritten ist und in der Vergangenheit mehrere widersprüchliche Studien dazu veröffentlicht wurden. In dieser Arbeit präsentiere einen Enzymaktivitätsassay, der die NAA-Synthese in Krebszellen und primären Neuronen direkt mit dem Zytosol und nicht mit den Mitochondrien verbindet. Ich demonstriere die metabolische Aktivität von NAT8L durch in vitro Synthese von [1-413C4]NAA aus [U-13C4]Asparaginsäure mittels GC-MS. Zusätzlich zeige ich die zytosolische Lokalisierung der NAA-Synthese durch siRNA-vermittelte Gen-Knockdowns. Die Innaktivierung von Genen, die zur Aufrechterhaltung der mitochondrialen Acetyl-CoA-Spiegel erforderlich sind, führten zu keiner Veränderung des NAA-Spiegels. Wenn NAA in den Mitochondrien produziert würde, müsste der Spiegel sinken, da Acetyl-CoA einer der Vorläufer für die NAA-Synthese ist. Wenn ich jedoch Gene inaktivierte, die zu den zytosolischen Acetyl-CoA-Spiegeln beitragen, wird der NAA-Spiegel signifikant reduziert. Mit siRNA-vermittelten Gen-Knockdowns habe ich gezeigt, dass die Expression von NAT8L für Krebszellen essentiell ist. Die Zellproliferation war nach dem Knockdown signifikant reduziert und konnte durch externes NAA nicht wiederhergestellt werden. Obwohl die NAA-Synthese im Zytosol stattfindet, hat es eine direkte Wirkung auf die Mitochondrien. Unter Verwendung stabiler Isotopenmarkierungen in Kombination mit Digitonin-permeabilisierten Zellen zeige ich, dass NAA die mitochondriale Glutaminoxidation und den Sauerstoffverbrauch erhöht. Außerdem zeige ich, dass dieser Effekt nicht auf den Abbauprodukten (Asparaginsäure und Azetat) beruht, sondern auf dem vollständigen NAA-Molekül selbst. In Übereinstimmung mit diesen Daten fand ich keine Expression der Aspartoacylase in Krebszellen, was neben der Rolle als Kohlenstoffquelle auf eine Signalfunktion von NAA hindeutet.
Databáze: OpenAIRE
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